油茶樹嫩枝精油抗氧化性及抑菌性研究

張玉龍，張偉，敬思群，吳飛虎

1.韶關市友豐生態園林開發有限公司（韶關 512005）；2.韶關學院英東食品學院（韶關 512005）；3.新疆大學生命科學與技術學院（新疆 830046）

植物精油具有天然、安全、綠色、環保等優勢，其應用領域逐漸滲透到食品、制藥、康養等領域。植物精油有解熱止痛、安眠、殺菌消炎[1]、降三高[2]、防止癌癥和腫瘤[3]、增強免疫功能[4]、延緩衰老[5]、生物保鮮[6]等功效。對精油抑菌活性、抗氧化生物活性的研究一直是近年來研究熱點[6-11]。

油茶（Camellia oleifera），又名茶籽樹，是中國重要的木本油料樹種。通常在種植油茶樹的時候，剪枝是增加產量的一個重要方法，在春季的油茶樹剪枝，就是直接避免生長素的分泌，使得結果開花率增加，即直接將尖端的嫩枝全部剪掉，再減掉很多小枝，增加橫向吸收陽光的面積的覆蓋率，提高結果的數量，因此會有一定量的油茶嫩枝被丟棄。油茶樹嫩枝精油又名刀煙，龍正海等[12]研究發現，其具有用于治療刀傷、燙傷、燒傷、急性炎癥、皮膚癌等的作用。關于油茶樹的研究主要集中于油茶籽綠色加工技術[13]、油茶籽油提取技術研究[14-15]、油茶籽油成分及品質分析[16-18]、油茶籽油理化性質及功效研究[19-20]，而鮮見油茶樹嫩枝精油的研究。

油茶樹是粵北地區特色經濟植物，韶關重點發展農作物之一，位于韶關的廣東友豐油茶科技有限公司擁有3萬畝油茶樹園。針對大量油茶嫩枝尚未開發利用的現狀，采用水蒸汽蒸餾法提取油茶樹嫩枝精油，利用氣相色譜-智譜聯用（GC-MS）分析油茶樹嫩枝精油組成成分，通過體外抗氧化模型 DPPH·自由基、ABTS+·自由基、總抗氧化能力評價精油的抗氧化活性，采用濾紙片法進行抑菌試驗，分析抑菌圈，測定最低抑菌濃度（MIC）。在為丟棄油茶嫩枝資源開發利用提供科學依據的同時，也將變廢為寶，具有一定生態效益，并推動韶關乃至粵北地區油茶產業鏈發展。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑和儀器

油茶樹嫩枝（采集于廣東友豐油茶科技有限公司油茶基地，采摘后進行清洗置于65 ℃干燥2 h，剪碎至1 cm左右，真空包裝待用）。

大腸桿菌（Escherichia coli，革蘭陰性菌G-）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革蘭氏陽性菌G+）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）（韶關學院英東生物與農業學院微生物實驗室）。

酵母浸膏、牛肉浸膏（上海展云化工有限公司）；瓊脂粉（北京奧博星生物技）；蛋白胨（南京茂捷生物科技有限公司）；抗壞血酸（純度99%，上海源葉生物科技有限公司）；維生素E（純度99%，浙江醫藥有限公司）；TBHQ（食品級，上海染料研究所有限公司）；1.1-二苯基-2-苦基肼（C18H12N5O6，分析純，梯希愛上海化成工業發展有限公司）；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（分析純，上海源葉生物科技有限公司）。

GT潔凈工作臺吳江和希凈化科技有限公司；Al-104電子天平（北京金科利達電子科技有限公司）；SHE-3000G酶標儀（北京賽爾福知心科技有限公司）；SPX-250BⅢ生化培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司）。

1.2 水蒸氣蒸餾法提取精油

油茶樹嫩枝精油地提取參考劉曉麗等[21]中水蒸氣蒸餾法，稍作改進：稱取一定量剪碎的油茶樹嫩枝放入蒸餾燒瓶中，蒸餾水與NaCl加入比例10∶1，加熱蒸餾，待提取器中油量不再增加時，停止加熱，冷卻后收集精油。

精油提取率計算如式（1）。

式中：E為精油提取率，%；m為油茶樹嫩枝精油質量，g；M為油茶樹嫩枝質量，g。

1.3 油茶樹嫩枝精油成分氣質聯用（GC-MS）分析

1.3.1 甲酯化處理

吸取0.3 mL油茶樹嫩枝精油于試管中，加入0.5 mL石油醚與乙醚（4∶3，V/V）混合溶液，加入0.5 moL/L氫氧化鉀-甲醇溶液0.4 mL，振蕩，靜置10～15 min。加入蒸餾水，靜置分層，取上清液進樣分析。

1.3.2 GC條件

色譜柱DB-5毛細管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3 min，程序升溫10 ℃/min，升溫至210 ℃，保持2 min，程序升溫5 ℃/min，升溫至280 ℃，保持3 min。進樣口溫度280℃、柱前壓43 kPa、載氣氮氣、進樣量0.5 μL、分流比20∶1，載氣流速1 mL/min。

1.3.3 MS條件

EI離子源，源溫200 ℃、電子能量70 eV、連接器溫度須230 ℃、質量掃描范圍（m/z）30～500。按峰面積歸一化法計算各組分相去對百分含量。

1.4 油茶樹嫩枝精油抗氧化性分析

1.4.1 抗壞血酸標品、維生素E標品、TBHQ標品溶液配制

分別用電子天平精密稱取樣品10 mg，用水溶解于100 mL容量瓶中定容至100 mL（溶液為100 μg/mL），精密取上述用水稀釋配制系列質量濃度4，8，12，16和20 μg/mL，用無水乙醇分別裝配質量濃度為4，8，12，16和20 μg/mL的油茶樹嫩枝精油，待用。以IC50值比較抗氧化能力，IC50值表示清除率為50%時，抗氧化劑的濃度，IC50值越小，抗氧化能力越強。

1.4.2 DPPH·自由基清除能力分析

參考劉艷燦等[22]的作法略做改進。以1.0 mL樣本溶液與1.0 mL濃度0.1 mmol/L DPPH·溶液，混合均勻后暗處放置30 min，無水乙醇作為參比溶液，在517 nm處測定其吸光度A，同時測定1.0 mL樣品溶液與1.0 mL無水乙醇混合后在517 nm處的吸光度A0，測定1.0 mL DPPH·溶液與1.0 mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光度A1，所有測定平行進行3次取平均值，按式（2）計算其清除率。

1.4.3 ABTS+·自由基清除能力分析

參照FAN ZL等[23]方法。ABTS+·工作液配制，取5.2 mmol/L過硫酸鉀溶液10 mL與7.4 mmol/L ABTS+·溶液20 mL進行混合，室溫、避光條件下放置12 h后，用無水乙醇稀釋40～50倍（A734nm=0.7±0.02），得ABTS+·工作液。將0.2 mL不同濃度樣品加入0.8 mL ABTS+工作液中，6 min后，于736 nm波長測定吸光度A。同時測定0.2 mL樣品溶液與0.8 mL無水乙醇混合液在736 nm處的吸光度A0，測定0.2 mL無水乙醇與0.8 mL ABTS+·工作液混合液在517 nm處的吸光度A1，所有測定平行進行3次取平均值，按式（3）計算其清除率。

1.4.4 總還原力測定

利用普魯士藍法測定來油茶樹嫩枝精油的還原能力。參照Jing等[24]方法并略做修改，取1 mL樣品溶液加入到裝有2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/mL，pH=6.6）的具塞試管中，再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻，于50 ℃恒溫水浴反應20 min，快速冷卻后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應，以4000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm下測吸光度（As），所有測定平行進行3次，取平均值。根據式（4）計算吸光度

式中：A為總抗氧化能力；As為樣品吸光度；A0為空白對照。

1.5 油茶樹嫩枝精油抑菌試驗

1.5.1 抑菌圈測定采用濾紙片法[24]

以生理鹽水作陰性對照，用0.2%山梨酸鉀溶液作陽性對照。真菌培養皿放在28 ℃下培養48 h后進行觀察記錄，細菌培養皿放在37 ℃下培養24 h后進行觀察記錄。測量其抑菌圈的大小，根據抑菌圈的大小[29]判斷活性的強弱抑菌圈大，則表明其活性強，抑菌圈小則表明其活性弱。

1.5.2 最小抑菌濃度（MIC）測定

將油茶樹嫩枝精油用95%乙醇分別配成含精油添加量1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%和8%溶液，取濾紙片（直徑6 mm，已滅菌）浸沒于上述配制的樣品溶液中，使其充分混勻，接于制作好的含菌培養皿中，每個組分對測試菌種分別做2個重復，并以液態營養瓊脂作為空白對照。將制好后的真菌培養皿在28℃恒溫培養48 h后觀察而細菌培養皿在37 ℃恒溫培養24 h后觀察，測量其抑菌圈的大小，以最先出現抑菌圈的濃度為最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 油茶樹嫩枝精油成分組成

由表1可知，以峰面積歸一化法分析各個組分的相對含量，從水蒸氣蒸餾提取的油茶樹嫩枝精油中鑒定出11種化合物，其中反-9-十八碳烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯、α-萜品醇、芳樟醇相對含量比較高，分別為33.01%，23.13%，14.18%和12.13%。這與龍正海等[2]的報道一致，但相對含量有差異，是由于油茶樹種植地區不同而致。

圖1 油茶嫩枝精油組成的TIC圖

表1 油茶樹嫩枝精油（水蒸氣蒸餾）GC-MS分析結果

2.2 油茶樹嫩枝精油抗氧化性

2.2.1 油茶樹嫩枝精油清除DPPH·自由基能力

由圖2A可知，油茶樹嫩枝精油具有一定清除DPPH·自由基能力，精油質量濃度20 μg/mL時，對DPPH·自由基清除能力達到58%，且呈劑量效應關系。油茶樹嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ對DPPH·自由基的IC50值分別為18.03±5.05 μg/mL、6.755±1.653 μg/mL、8.593±2.247 μg/mL、5.027±3.159 μg/mL；由圖2B可知，油茶樹嫩枝精油對ABTS+·自由基具有良好清除能力，在精油濃度20 μg/mL時，對ABTS+·自由基的清除能力達到67%，且呈劑量效應關系。油茶樹嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ對ABTS+·自由基的IC50值分別為10.19±7.409 μg/mL、4.709±2.955 μg/mL、5.678±2.369 μg/mL、5.729±4.406 μg/mL；由圖2C可看出，油茶樹嫩枝精油的總抗氧化能力隨著質量濃度增大而增大，與質量濃度呈正相關關系。質量濃度20 μg/mL時，油茶樹嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ的吸光度值分別為0.291，1.800，1.722和1.719，吸光度越大，其抗氧化能力越強，所以相對于陽性對照，精油的總抗氧化能力較弱。

圖2 油茶樹嫩枝精油抗氧化能力

2.3 油茶樹嫩枝精油抑菌性

2.3.1 抑菌圈分析

由表2可以看出，油茶樹嫩枝精油對所試菌均有抑制作用，以對細菌的抑制作用較強，對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（大腸桿菌）都有較好的抑制作，其次是酵母菌，對霉菌抑制作用最弱。

表2 油茶樹嫩枝精油的抑菌作用

2.3.2 油茶樹嫩枝精油對細菌，真菌和霉菌的最低抑菌濃度

由表3可通過看出油茶樹嫩枝精油對大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值為4%，對金黃色葡萄球菌的MIC值為5%，對革蘭陰性菌的抑菌效果優于革蘭陽性菌。油茶樹嫩枝精油對酵母菌的MIC值為6%，而對黑曲霉與根霉的MIC值為8%，說明油茶樹嫩枝精油對細菌的抑制作用要強于對真菌與霉菌的，且對大腸桿菌抑制效果最強。

表3 油茶樹嫩枝精油的最小抑菌濃度試驗結果

2.3.3 分析比較

將油茶樹嫩枝精油的抑菌性與肉桂精油通過及黃花忍冬果精油抑菌性做比較，見表4。

由表4抑菌圈直徑可以看出，油茶樹嫩枝精油對細菌的抑菌作用強于黃花忍冬果精油，但弱于肉桂精油去對細菌的抑菌性，相去對來說是一種抑菌效果較好的廣譜抑菌劑；從最小抑菌濃度來看，油茶樹嫩枝精油對細菌、霉菌的最小抑菌濃度均比黃花忍冬果精油小，但比肉桂精油略大。

表4 3種精油的抑菌效果比較分析

3 結論

水蒸氣蒸餾法提取油茶樹嫩枝精油的提取率為0.045%；油茶樹嫩枝精油經GC-MS分析，從水蒸氣蒸餾提取的油茶樹嫩枝精油中鑒定出11種化合物，其中反-9-十八碳烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯、α-萜品醇、芳樟醇相去對含量比較高，分別為33.01%，23.13%，14.18%和12.13%。

油茶樹嫩枝精油具有良好的體外抗氧化能力，可作為一種新型的天然的抗氧化劑。油茶樹嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ對DPPH·自由基清除能力IC50值分別為18.03±5.05 μg/mL、6.755±1.653 μg/mL、8.593±2.247 μg/mL、5.027±3.159 μg/mL，對ABTS+·自由基清除能力IC50值分別為10.19±7.409 μg/mL、4.709±2.955 μg/mL、5.678±2.369 μg/mL、5.729±4.406 μg/mL，并呈劑量關系；油茶樹嫩枝精油總抗氧化能力與質量濃度呈正相關，質量濃度20 μg/mL油茶樹嫩枝精油、抗壞血酸、維生素TBHQ的總抗氧化能力用吸光度表示分別為0.291，1.800，1.722和1.719。油茶樹嫩枝精油具有一定抗氧化活性。

油茶樹嫩枝精油對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，酵母菌，根霉和黑曲霉均有抑制作用。油茶樹嫩枝精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、根霉及黑曲霉的抑菌圈分別為14.1±0.2 mm、11.1±0.1 mm、9.7±0.5 mm、6.4±0.5 mm、6.6±0.4 mm；對大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值為4%，對金黃色葡萄球菌，根霉，酵母菌和黑曲霉的MIC值分別為5%，8%，6%和8%。油茶樹嫩枝精油對大腸桿菌的抑制作用最強。