原子熒光光譜法測定雞肉硒含量的優化研究

莊坤，劉凱，孫威，胥偉

1.武漢輕工大學食品科學與工程學院（武漢 430023）；2.新疆生產建設兵團六師五家渠市食品藥品檢驗所（五家渠 830013）

硒元素作為人體必需的14種微量元素之一[1]，在人體健康中起到抗氧化、抗病毒感染、預防癌癥、提免疫力、重金屬解毒、維持正常生殖功能等作用[2]。在中國低硒地區攝入的硒元素缺失會引起2種典型疾病——克山病（地方性心肌病）、大骨節病（變形關節炎）[3]。有資料顯示調查中國13個省市成年人平均每日硒攝入量為26.63 μg，低硒區人群僅為3～11 μg[4]，遠低于世界衛生組織推薦的50 μg的標準[5]，中國將富硒食品作為營養補充的重要方式，因此不同富硒食品體系中硒含量檢測方法的專用性研究顯得尤為重要。總硒含量的檢測方法很多，主要包括比色法、熒光分光光度法[6]、氫化物-原子熒光法[7]、火焰原子吸收法[8]、催化動力學光度法、高效液相色譜法[9]和電感耦合等離子體質譜法[10]等。氫化物-原子熒光光譜法由于具有靈敏度高、干擾少、儀器操作簡單等諸多特點[11]，是較為普及的總硒含量測定方法[12]。市面上富硒食品種類繁多，各類食品在樣品消解和預還原等方面效果大相徑庭，籠統的檢測方法會導致結果的明顯差別。因此，試驗針對富硒雞肉產品的樣品特點，重點研究樣品前處理、預還原方法、試劑體系等方面對雞肉產品總硒含量檢測結果的影響，建立一種既準確又穩定的測定雞肉產品中總硒含量的氫化物-原子熒光光譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒雞肉（由市場采購，各種雞肉樣品經過清洗去皮去骨后，由均質機攪拌至肉泥狀，用自封袋包裝后放入冰箱冷藏待用）。

鹽酸、硝酸（優級純，國藥集團）；氫氧化鉀、鐵氰化鉀、硼氫化鉀（分析純，國藥集團）；硒標準溶液（1000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

1.2 儀器與設備

SK2003AZ原子熒光光譜儀（北京金索坤技術開發有限公司）；Milli-Q Integral超純水機（美國Millipore公司）；HS-26恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DB-3EFS電熱板（陜西海聯化玻儀器化工有限公司）；Multiwave PRO微波消解儀（美國CEM公司）。

原子熒光光譜儀工作參數：負高壓300 V；燈電流80 mA；積分時間5 s；主氣流量600 mL/min；輔氣流量800 mL/min；測量方式標準曲線法；延遲時間3 s。

1.3 方法

1.3.1 硒標準曲線繪制

取10 mL硒標準儲備液（1000 mg/L）定容于100 mL容量瓶中，制備成硒標準中間液（100 mg/L）；取1 mL硒標準中間液（100 mg/L）定容于100 mL容量，制備成硒標準使用液（1 mg/L）；準確量取0，1.0，2.0，5.0和10.0 mL標準硒標準使用液分別定容于100 mL容量瓶中，混合均勻，配制質量濃度0，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/L的系列硒標準溶液，標準溶液均采用介質酸定容。

1.3.2 介質酸及還原劑的濃度研究

在固定還原劑質量分數1.5%硼氫化鉀（KBH4）+0.5%氫氧化鉀（KOH）情況下，分別使用體積分數5%，7%，9%，10%，11%和13%的HCl作為介質酸，考察HCl濃度對硒元素熒光強度的影響。

在固定介質酸中HCl體積分數10%，還原劑中KOH濃度0.5%情況下，分別將還原劑中KBH4質量分數定為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%，考察KBH4質量分數對熒光強度的影響。

試驗均采用5 μg/L硒標準溶液作為檢測熒光強度的樣品。

1.3.3 消解方式及消解液配比的比較

精確稱取0.5000±0.0001 g雞胸肉樣品，分別使用濕法消解和微波消解兩種方式，對比在相同的消解液體系中2種消解方式對樣品消解效果的影響。考慮到儀器設備使用要求和雞肉樣品特性，選擇硝酸（HNO3）-過氧化氫（H2O2）的消解酸體系，在消解酸總體積恒定為12 mL的情況下，探討HNO3∶H2O2質量分數梯度（5∶1，3∶1，2∶1，7∶5和1∶1）對雞肉樣品消解效果的影響。

1.3.4 預還原方法的比較

在預還原部分設計3種試驗方法，分別為：HCl（6 mol/L）電熱板法，在消解殘夜中加入5 mL HCl（6 mol/L）電熱板加熱100 ℃預還原至溶液約1 mL；濃HCl電熱板法，在消解殘夜中加入5 mL濃HCl電熱板加熱100 ℃預還原至溶液約1 mL；沸水浴還原法，待消解殘液冷卻后，加入30 mL 10% HCl，用保鮮膜封口水浴20 min。

該部分試驗需要精確稱取0.5000±0.0001 g雞胸肉，同時消解以后分別按照上述3種預還原方法進行試驗檢測各樣品熒光強度，考察每種預還原方法對樣品熒光強度的影響。

1.3.5 沸水浴還原方法的條件優化

對沸水浴還原法中加入HCl溶液濃度、沸水浴時間和HCl溶液添加體積3個條件進行優化，3個條件設計梯度依次為HCl溶液體積分數（8%，10%，12%，14%和16%），沸水浴時間（10，15，20，25和30 min），HCl溶液添加體積（10，15，20，25和30 mL）。

1.3.6 精密度及回收率試驗

精密度試驗使用相對標準偏差（SRSD）表示，其代表測量的重現性且是試驗數據準確的重要條件。按照優化的試驗條件對4種雞肉產品分別進行6次重復的檢測，計算相對標準偏差（SRSD），探討優化后試驗方法的精密度。

根據4種富硒雞肉產品檢測出的硒含量結果，分別加入不同質量分數的硒標準溶液（雞肉干500 μg/kg、雞腿肉200 μg/kg、雞胸肉100 μg/kg、雞翅肉30 μg/kg）進行加標回收率檢測。

1.4 數據處理

采用SPSS軟件對每組試驗的6次重復試驗數據進行分析，確定方差是否具有統計學上的同質性，結果用均數±SRSD表示，繪圖使用Microsoft Excel 2007軟件完成。

2 結果與分析

2.1 介質酸及還原劑的濃度研究

根據GB 5009.93—2017中第一法氫化物原子熒光光譜法要求，以及所用原子熒光光譜儀自身設備的要求，在檢測硒元素時，選擇一定體積比濃度的HCl作為硒元素溶解的介質酸，選擇KBH4-KOH混合溶液作為氫化反應的還原劑，其中KBH4是將Se還原并生成H2Se的還原劑，因此在配制介質酸和還原劑時，其濃度對檢測的熒光強度有顯著影響。

2.1.1 HCl介質酸濃度的選擇

由圖1可以看出：介質酸中HCl體積分數的提高對硒元素熒光強度在一定范圍內有提升作用，HCl體積分數達到9%時，硒元素熒光強度的上升趨勢明顯減緩，但HCl體積分數大于10%，硒元素的熒光強度基本維持在910左右，總體趨于穩定，故介質酸中HCl體積分數應≥10%。

圖1 HCl體積分數對硒元素熒光強度的影響

通過試驗發現，介質酸中HCl及還原劑中KBH4質量分數對硒元素熒光強度影響明顯，在茍體忠[13]、胡婷[14]等研究發現，介質酸中HCl體積分數過高或過低對硒元素的熒光強度均造成減弱影響，而在試驗中，HCl體積分數在10%～13%區間中硒元素熒光強度趨于穩定不變，這與劉恒等[15]的研究結果相似，推測可能是由于HCl體積分數最高僅13%，未達到減弱熒光強度的拐點值，因此介質酸中HCl體積分數應在10%～13%。

2.1.2 還原劑中KBH4質量分數的選擇

觀察圖2中數據變化可以發現，硒元素的熒光強度隨著KBH4質量分數提升呈現先增加后減少變化趨勢，其中KBH4質量分數在0.5%～1.5%，硒元素熒光強度呈現迅速上升，KBH4質量分數在1.5%～3.0%區間，硒元素熒光強度逐漸出現下降，KBH4質量分數1.5%時熒光強度為最高值929.0，后續試驗選擇還原劑中KBH4質量分數1.5%。

圖2 硼氫化鉀濃度對硒元素熒光強度的影響

還原劑中KBH4在介質酸中與Se4+反應生成H2Se，原子化后在硒元素空心陰極燈照射下發生特定波長的熒光，因此還原劑中KBH4質量分數會顯著影響檢測到的熒光強度[16]。KBH4質量分數1.5%時熒光強度升至最高點，KBH4質量分數大于1.5%后熒光強度出現下降，故選擇1.5%作為還原劑中KBH4質量分數。陳曉霞等[17]在研究中分析原因是KBH4質量分數較低時Se原子氫化反應不完全，檢測到的熒光強度弱；KBH4質量分數過高時氫化反應過于劇烈，不但產生過量氫氣稀釋Se原子蒸汽，同時造成原子化器火焰增強，增加設備噪聲，導致熒光強度降低。

2.2 標準曲線的制作

結合GB 5009.93—2017[18]和一般富硒雞肉產品硒元素含量，選擇0，1，2，5和10 μg/L 5個質量濃度點制作硒元素標準曲線。由圖3可以看出：R2為0.99948，說明在硒元素質量濃度小于10.0 μg/L區間內與儀器所測熒光強度值的線性擬合關系較好，該批次硒元素檢測的標準曲線為y=154.55x+180.92。

圖3 硒元素標準曲

2.3 不同消解方式及消解液配比的比較研究

使用濕法消解和微波消解2種方式，分別按照試驗設計的HNO3與H2O2體積比進行消解驗證試驗。從圖4可以看出，在恒定為12 mL的消解液中，隨著H2O2在體系中占比增加，濕法消解樣品的熒光強度總體呈現先增后減趨勢，而微波消解樣品的熒光強度呈現先增加后趨于穩定的變化趨勢。HNO3與H2O2體積比7∶5時，濕法消解的熒光強度達到高值拐點329.8，是5組樣品中熒光強度最高值，而微波消解方式在該體積比條件下熒光強度（340.6）與體積比1∶1時熒光強度（342.5）無顯著差異。在相同比例的條件下，微波消解的熒光強度總體上要比濕法消解高一些。結果表明，在雞肉消解過程中，無論是濕法消解還是微波消解，選擇HNO3與H2O2體積比7∶5作為消解酸的最適配比，如果條件允許，優先選擇微波消解方法。

圖4 不同消解方式及消解液配比對樣品熒光強度的影響

在元素含量檢測中樣品的消解方式很多，但GB 5009.93—2017[13]中僅對濕法消解和微波消解進行詳細說明，試驗對2種消解方式進行比較研究，發現無論是濕法消解還是微波消解，選擇HNO3與H2O2體積比7∶5作為消解液的最適配比。在相同比例的條件下，微波消解的熒光強度總體上要比濕法消解高一些，這是由于在濕法消解過程中，一方面由于H2O2加熱后產品大量泡沫會黏在錐形瓶玻璃壁，造成樣品損失[19]，另一方面電熱板溫度控制不規范時，造成加熱過程中形成氫化物逸出[20]。因此如果條件允許，優先選擇微波消解方法。

2.4 預還原方法的比較及條件優化研究

2.4.1 預還原方法的比較

對比表1中3種預還原方法所測雞胸肉的熒光強度結果具有一定差異性，濃HCl電熱板法所測樣品的熒光強度最低，且所測結果的標準差較大；HCl（6 mol/L）電熱板法與沸水浴還原法所測熒光強度差異微弱（p＜0.05），但沸水浴還原法檢測結果的標準差較小，說明使用沸水浴加熱的預還原方法能夠更完全地將雞肉消解液中的Se6+還原成Se4+，并且檢測組別間的數據穩定性更好。

表1 預還原方法的比較

樣品在經過消解后硒元素被氧化為Se6+，但Se6+無法直接與KBH4反應生成H2Se，還需要利用HCl溶液對消解液進行預還原處理，將Se6+還原成Se4+以便后續氫化反應。由于硒元素易揮發，在還原過程中加熱溫度過高會造成硒元素揮發損失[21]，因此試驗中設計的3種預還原方法的加熱溫度均在100 ℃，結果表明，濃HCl電熱板法所測結果最低，而沸水浴還原法和HCl（6 mol/L）電熱板加熱法的檢測結果較好且相近，但沸水浴還原法檢測結果的穩定性更強。這可能是由于電熱板加熱在排煙過程中硒元素可能會形成揮發性的氯化物而損失[22]，濃HCl造成預還原過程中用酸濃度太高容易伴生干擾離子，從而影響硒含量的測試結果[23]。

2.4.2 沸水浴預還原法條件的優化

由圖5可以發現：HCl體積分數達到12%后，硒元素的檢測結果才達到穩定；添加25 mL HCl溶液時硒元素的檢測結果趨于穩定；預還原在沸水浴20 min之后樣品檢測的硒元素結果趨于穩定。因此，沸水浴還原法經過優化后條件為：選擇添加25 mL 12%的HCl溶液沸水浴20 min。

圖5 HCl體積分數、添加體積和沸水浴時間對樣品硒含量檢測結果的影響

在沸水浴還原法中HCl體積分數、添加量和水浴時間都是影響Se6+能否完全被還原成Se4+的重要因素，經過單因素試驗之后發現最優沸水浴還原法條件為：添加25 mL 12%的HCl溶液沸水浴20 min。綜合2.1.1介質酸中HCl體積分數選擇結果，HCl體積分數10%～13%時中硒元素熒光強度穩定，考慮到減少預還原中HCl體積分數與介質酸中HCl體積分數不同對總硒含量檢測結果的影響，因此，確定介質酸中HCl體積分數為12%。

2.5 富硒雞肉產品檢測結果、精密度及回收率

由表2中所測數據可以看出，雞肉干樣品的總硒含量最高，達到474.55 μg/kg，雞翅肉的硒含量最少，只有26.77 μg/kg，雞腿肉和雞胸肉分別為159.97 μg/kg和183.35 μg/kg。4種富硒雞肉樣品按照上述優化后的方法分別進行6組試驗，4種樣品所測結果的標準偏差依次為1.29%，0.89%，1.53%和1.21%（n=6），均小于5%，說明該方法對雞肉產品總硒含量的檢測精密度較高[24]。根據4種富硒雞肉樣品總硒含量檢測結果分別加入不同濃度的硒標準溶液進行檢測，該檢測方法回收率分別為99.25%，103.01%，101.46%和104.76%。

表2 富硒雞肉樣品中硒含量檢測結果（n=6）

經過方法改進優化后，4種富硒雞肉產品檢測得到的總硒含量在26.77～474.55 μg/kg，SRSD為0.89%～1.53%，回收率為99.25%～104.76%，說明該方法用于檢測雞肉中總硒含量的精密度和回收率都較好。

美國國家科學院食物營養學會在1989年推薦硒的膳食供給量中成年男性為70 μg/d，女性為55 μg/d[25]，2000年中國營養學會制定的《中國居民膳食營養素參考攝入量》中推薦的承認硒攝入量為50 μg/d，成人最高可耐受硒攝入量為450 μg/d[26]。陜西地方標準（DB61/T 557.15—2012）中富硒雞肉產品硒含量要求為0.02～0.50 mg/kg[27]，說明硒含量小于20 μg/kg的屬于非富硒雞肉產品，硒含量高于500 μg/kg的屬于硒含量超標雞肉產品，過度食用會引起硒中毒。4種富硒雞肉產品的總硒含量符合陜西地方標準要求范圍，其中雞肉干（474.55 μg/kg）硒含量雖然超過中國營養學會要求的最高耐受硒攝入量（450 μg/kg），但考慮到中國大部分地區缺硒，只要不長期食用該雞肉干產品，不會對人體健康造成較大影響[28]。

3 結論

通過對溶液配制、消解處理和預還原處理等方面試驗條件的優化研究，建立適合檢測富硒雞肉產品中總硒含量的氫化物-原子熒光光譜法。在GB 5009.93—2017相關方法的基礎上進一步優化比較發現，濕法消解和微波消解中選擇7∶5混合酸（HNO3∶H2O2）的效果最佳，相同條件下微波消解效果最好；介質溶液選擇體積分數12%的HCl，還原劑溶液中KBH4質量分數1.5%；預還原時沸水浴還原法效果好，檢測穩定性高，最優條件為12%的HCl添加25 mL后沸水浴20 min。

利用上述條件檢測出4種富硒雞肉產品的總硒含量分別為雞肉干474.55 μg/kg、雞翅肉26.77 μg/kg、雞腿肉159.97 μg/kg、雞胸肉183.35 μg/kg。SRSD為0.89%～1.53%，回收率為99.25%～104.76%，說明該方法對雞肉產品中硒含量的檢測精密度高、回收率高、檢測穩定。