基于鉑包金的啶蟲脒間接競爭酶聯免疫檢測方法的構建

丁然，王元鳳，桑麗雅，魏新林

1.上海交通大學農業與生物學院（上海 200240）；2.上海師范大學生命科學學院（上海 200234）；3.杭州南開日新生物技術有限公司（杭州 311200）

啶蟲脒作為一種新煙堿類高效殺蟲劑，廣泛應用于谷物、棉籽、蔬果、茶葉等種植。有研究顯示啶蟲脒具有一定的基因毒性及細胞毒性，會對人體神經系統產生不良影響，或誘發DNA損傷等[1-3]。因而，有必要建立高效的啶蟲脒檢測方法。免疫學分析方法具有快速、高靈敏度、特異性強等優點，被廣泛應用于農藥殘留的檢測中。然而，由于該方法中常用的信號標記物辣根過氧化物酶（HRP）不穩定、易失活，極大地限制了其在檢測中的應用。鉑包金納米粒子是一種雙金屬納米材料，由于其較強的催化作用，可作為納米模擬酶應用于免疫學分析，提高檢測結果的靈敏度和可靠性[4-6]。相較于鉛包金、鉑包鉛等模擬酶，鉑包金納米粒子具有更安全、產物精準可控的優勢。目前基于鉑包金的酶聯免疫方法多是用于檢測大分子的雙抗夾心檢測法[7-10]，其在小分子檢測領域中的應用仍是空白。

試驗以小分子（啶蟲脒）為目標物，利用抗原、抗體的特異性識別體系及鉑包金納米粒子的類酶催化活性，設計一種能應用于小分子檢測的基于鉑包金的間接競爭酶聯免疫方法。在該方法中，鉑包金納米粒子能催化氧化3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）產生藍色的氧化產物，從而實現定量檢測。該檢測方法填補鉑包金納米粒子在小分子酶聯免疫檢測中的空白，為其商業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啶蟲脒標準品（源葉生物）；啶蟲脒抗原與抗體（無錫杰圣杰康生物）；羊抗小鼠IgG（上海杰一生物技術有限公司）；吐溫20、明膠、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）（北京索萊寶公司）；其余試劑（國藥公司）。

ELISA試驗所用緩沖溶液參考姚蕾珺[1]的配方。

1.2 儀器與設備

AMR-100酶標儀（杭州奧盛）；T6PC新世紀紫外-可見光分光光度計（北京普析通用）；微量注射泵（保定迪睿電子科技有限公司）；120 kV透射電鏡（Thermo Scientific）；電子順磁共振波譜儀（德國布魯克公司）。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs的制備

將100 mL HAuCl4（0.01%）溶液加入到150 mL錐形瓶中，磁力攪拌器攪拌至沸，轉速150～200 r/min；保持沸騰狀態5 min后，快速加入2 mL檸檬酸鈉溶液（1.0%），繼續加熱攪拌至溶液澄清透亮且顏色不再變化，停止反應并冷卻至室溫，于4 ℃儲藏備用。所有玻璃儀器均需在酸洗液中浸泡過夜并用超純水洗凈，轉子需在王水中浸泡過夜并用超純水洗凈。

1.3.2 Au@Pt NPs的制備

將30 mL AuNPs溶液加入到150 mL錐形瓶中，并依次加入224 μL H2PtCl6溶液（10 mmol/L）和H2O（18.656 mL）。磁力電加熱板攪拌加熱至80 ℃，轉速150～200 r/min；微量注射泵驅動注射器以0.2 mL/min緩慢加入L-抗壞血酸溶液（1.12 mL，10 mmol/L），持續加熱30 min后停止反應，冷卻至室溫，4 ℃儲藏備用。

1.3.3 Au@Pt NPs的動力學分析

室溫（22 ℃）下依次將TMB A液（2 mL）、不同濃度TMB B液（400 μL）和Au@Pt（480 μL）溶液加入比色皿（1 cm）中，迅速混勻后用UV-Vis分光光度計監測λ=652 nm下樣品溶液在0～300 s內的動態吸光度變化（間隔=1 s）。利用Origin Pro 9.0軟件計算每個動態反應曲線（不同TMB濃度）的初始斜率（SlopeInitial），根據Michaelis-Menten方程獲得非線性回歸擬合初始反應速度v，表觀動力學參數Km及最大反應速度Vmax，并通過方程式（1）計算催化常數Kcat[6,11]。

式中：Vmax為最大反應速度，10-8mol/L·s；CAu@PtNPs為Au@Pt NPs濃度，10-8mol/L。

1.3.4 Au@Pt NPs-IgG制備[4]

取上述Au@Pt NPs溶液（8.5 mL），加入適量K2CO3溶液（0.1 mol/L）調節溶液pH；渦旋后加入一定濃度的羊抗小鼠IgG（0.85 mL），室溫搖床震蕩1 h，37 ℃孵育12 h后，以10000 r/min離心15 min，棄上清液，將沉淀物用PBS緩沖液（pH 7.4）復溶后，再次離心取沉淀物，重復2次后用PBS緩沖液（pH 7.4）溶解至5.1 mL，于4 ℃儲存備用。

1.3.5 ic-ELISA構建

在酶標板中添加包被抗原（每孔100 μL），于37℃孵育2 h，洗滌液（每孔250 μL）洗板3次，拍干；添加封閉液（每孔200 μL），于37 ℃孵育2 h，洗滌液（250 μL/孔）洗板3次，拍干；先后添加不同濃度啶蟲脒溶液（每孔50 μL）和抗體（每孔50 μL），于37 ℃孵育0.5 h，洗滌液（每孔250 μL）洗板3次，拍干；添加上述Au@Pt NPs-IgG溶液（每孔100 μL），37 ℃孵育0.5 h，洗滌液（每孔250 μL）洗板6次，拍干；加入現配顯色液（每孔100 μL），37 ℃孵育15 min，加入終止液（每孔50 μL）終止顯色，并用酶標儀在λ=450 nm下測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 AuNPs和Au@Pt NPs結構表征

圖1（A）TEM電鏡圖顯示，AuNPs（1.18×10-9mol/L）在水溶液中為均勻分散的球形納米顆粒。圖1（B）粒徑分布圖顯示其平均粒徑為16.94±1.89 nm。以此AuNPs作為種子制備獲得Au@Pt NPs（4.15×10-10mol/L），反應過程中觀察到溶液由酒紅色變為紅棕色。結合圖1（C）透射電鏡圖及圖1（D）粒徑分布圖可知，Au@Pt NPs平均粒徑為18.63±2.13 nm，比AuNPs大1.69 nm，初步推測Au@Pt NPs表面沉積有鉑原子。由于金和鉑具有相似的原子質量和晶格常數，無法通過透射電鏡清楚區分金和鉑。結合圖1（E）紫外-可見光吸收圖譜發現，Au@Pt NPs在508.4 nm處出現強局部表面等離子體共振（LSPR）峰，相較于AuNPs在519.8 nm處的LSPR峰，發生顯著藍移，這與Gao等[12]的研究結果相同。這些結果表明金納米粒子表面成功形成鉑殼。圖1（F）中單個Au@Pt NPs的中心軸方向線掃描EDX光譜進一步證明，Au@Pt NPs為鉑包金的殼核結構。

圖1 AuNPs和Au@Pt NPs結構表征

2.2 Au@Pt NPs類酶活性研究

通過H2O2-TMB催化模型研究Au@Pt NPs的類過氧化物酶催化活性。反應過程中發現，只有TMB溶液中同時加入H2O2和Au@Pt NPs后，溶液迅速由無色變為藍色。紫外-可見光吸收光譜分析可知，如圖2所示：[TMB+H2O2+Au@Pt NPs]反應溶液出現TMB藍色氧化產物的特征吸收峰（λmax=651 nm）。結果證實Au@Pt NPs具有類過氧化物酶催化活性。

圖2 基于Au@Pt NPs模擬酶活性的光度分析圖譜

結合電子順磁共振EPR圖譜可進一步觀測在H2O2中加入Au@Pt NPs后H2O2產生的羥基自由基變化。圖3（A）顯示純化后的自由基捕獲劑DMPO沒有吸收信號，表明不存在羥基自由基。圖3（b）顯示在365 nm紫外光照下誘導H2O2產生的·OH，可被溶液中DMPO捕獲并產生較強的吸收信號。圖3（c）顯示：在DMPO溶液中迅速加入H2O2及Au@Pt NPs并在365 nm紫外光照誘導后，EPR光譜圖沒有吸收信號，表明溶液中DMPO幾乎未捕獲到·OH。這可能是由于H2O2產生的·OH通過其孤對電子與Au@Pt NPs的導帶電子之間發生交換作用，·OH被固定在Au@Pt NPs表面[13]，導致EPR吸收信號減弱甚至消失。不同物質的催化效率可由親和常數（Km）與速率常數（Kcat）的比值（Kcat/Km）表示。通過動力學分析計算可得，Au@Pt NPs的催化效率Kcat/Km=104，比辣根過氧化物酶HRP的催化效率（Kcat/Km=103）高出一個數量級，表現出高效的類過氧化物酶催化活性。

圖3 EPR光譜圖

2.3 間接競爭 ELISA的構建

2.3.1 Au@Pt NPs-IgG的制備與優化

對Au@Pt NPs-IgG偶聯環境的pH、偶聯用羊抗小鼠IgG的質量濃度及孵育時間進行優化。

對Au@Pt NPs-IgG偶聯環境的pH進行研究。一般來說，當反應體系的溶液顏色與Au@Pt NPs溶液顏色一致，呈棕紅色且靜置2 h后未發生改變時，表明Au@Pt NPs-IgG狀態穩定；反應體系溶液由棕紅色變為藍色時，表明Au@Pt NPs-IgG發生不可逆轉的聚集。研究結果顯示，在Au@Pt NPs-IgG制備體系中，1 mL Au@Pt NPs溶液中添加7 μL 0.1 mol/L K2CO3得到的偶聯物最穩定。Au@Pt NPs在酶標板上的高非特異性吸附易導致ELISA檢測結果呈假陽性，可通過增加偶聯物中IgG質量濃度來降低檢測體系背景值（陰性孔吸光度），提高其準確性。如圖4所示：IgG添加量達到0.4 mg/mL時，陰性孔/陽性孔的吸光度比值顯著降低；另外，發現在0.4 mg/mL IgG質量濃度下37 ℃孵育12 h后，陰性孔/陽性孔的吸光度比值降至0.2～0.3，符合ELISA檢測的要求。綜上可得Au@Pt NPs-IgG制備的最優條件為：1 mL Au@Pt NPs，7 μL 0.1 mol/L K2CO3，0.4 mg/mL羊抗小鼠IgG，于37 ℃孵育12 h。

圖4 偶聯用羊抗小鼠IgG的濃度優化

2.3.2 反應條件優化

為提高檢測方法的靈敏度，對標品稀釋液中的甲醇添加量、顯色液孵育時間、PBS溶液的離子強度及pH 進行優化。圖5（A）顯示：隨著甲醇添加量增加，零標孔吸光度逐漸變大，但抑制曲線的IC50值也隨之增大。這主要是由于甲醇增強抗原抗體間親和力的同時，也提高標準品在酶標板上的非特異性吸附，繼而減弱抑制效果。因此，選擇不含甲醇的PBS緩沖液作為標準品稀釋液進行啶蟲脒間接競爭ELISA檢測體系構建。圖5（B）顯示：隨著孵育時間增加，零標孔吸光度變大，抑制曲線的IC50值變小。由于孵育20 min時，零標孔吸光度在ELISA反應的最適吸光度范圍內，因此最優控制顯色液孵育時間選為20 min。圖5（C）顯示：隨著離子強度增大，零標孔吸光度發生明顯下降，但抑制效果卻顯著提升，這可能是由于離子強度增強致使抗體蛋白的結構發生改變。因此，PBS緩沖液作為抗體稀釋液的最優濃度為50 mmol/L。圖5（D）顯示：PBS緩沖液pH 8.0時，零標孔吸光度增大，同時抑制曲線的IC50值減小，表明pH增加有助于靈敏度提升。因此，選擇pH 8.0的PBS緩沖液用于后續試驗。

圖5 反應條件優化

2.4 啶蟲脒標準抑制曲線的建立

以啶蟲脒標品濃度為橫坐標，反應溶液OD450值為縱坐標，通過Origin 9.0軟件繪制基于鉑包金的啶蟲脒間接競爭ELISA標準抑制曲線。如圖6所示：該抑制曲線的回歸方程為y=0.36+1.27[1+（x/4.5）0.67]，R2=0.9955；線性檢測范圍（IC20～IC80）為0.57～35.70 ng/mL，最低檢出限（IC10）為0.167 ng/mL。

圖6 啶蟲脒標準抑制曲線

2.5 交叉反應率的測定

在標品稀釋液中分別加入500 ng/mL的噻蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、啶蟲脒及吡蟲啉標品，使用試驗建立的間接ELISA方法進行檢測。結果如圖7所示：只有加入啶蟲脒標品時，標品與包被原發生競爭，致使溶液在λ=450 nm處的吸光度顯著降低，說明試驗檢測方法具有良好的特異性。

圖7 試驗檢測方法對啶蟲脒的特異性

3 結論

以啶蟲脒為目標物，基于抗原、抗體的特異性識別體系及鉑包金納米粒子的類過氧化氫酶催化活性，設計一種高靈敏度、高選擇性的間接競爭ELISA檢測方法。在該方法中，鉑包金納米粒子能催化氧化TMB產生藍色氧化產物，并在滴加終止液后于450 nm處產生紫外吸收峰，從而實現定量檢測。在最優條件下，該方法的最低檢出限達0.167 ng/mL，線性范圍為0.57～35.70 ng/mL。