HPLC定量檢測小麥粉中苯甲羥肟酸

付萌，韓建勛, ，宋薇，富玉，張雅莉，李婷

1.譜尼測試集團北京檢驗認證科學研究院有限公司（北京 100095）；2.譜尼測試集團股份有限公司（北京 100095）

苯甲羥肟酸[1-2]是一種金屬絡合試劑和高效的礦物捕獲劑，然而一些廠家為進一步增強面粉的筋度、白度、蓬松度等[3]，在小麥粉或面粉改良劑中非法添加苯甲羥肟酸。研究表明苯甲羥肟酸的大鼠口服致死中量（LD50）大于500 mg/kg，且苯甲羥肟酸是比較難降解的有機物[4]，對人類和生態環境存在潛在的風險和危害。原國家食品藥品監督管理總局[5]多次發布公告，要求各地嚴格監控面粉質量安全，其中苯甲羥肟酸為重點關注有毒有害物質之一。

苯甲羥肟酸的檢測方法主要有液相色譜法[6]、紅外光譜法[7-9]、紫外分光光度法[10-11]等，但相關研究多集中于礦物浮選方面。有研究[12]采用高效液相色譜-質譜技術定量檢測面粉改良劑中苯甲羥肟酸的含量，雖然檢測靈敏度高，但儀器價格昂貴、普適性較低。高效液相色譜技術已相當成熟，被廣泛應用于食品中營養成分、有毒有害物質等[13-24]各方面的定性定量檢測，在食品安全監測領域發揮越來越重要作用。為有效檢測小麥粉中苯甲羥肟酸含量、避免非法添加威脅人體健康，試驗建立一種適用于小麥粉中苯甲羥肟酸的高效液相色譜定量檢測方法，并與國家市場監督管理總局發布的BJS 202002《小麥粉及其面粉改良劑中苯甲羥肟酸的測定》補充檢驗方法進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

21份小麥粉（市售，樣品信息見表1）。

表1 樣品信息

苯甲羥肟酸（99.0%，Sigma公司）；苯甲酸（99.5%，Sigma公司）；甲醇（色譜純，Fisher Scientific公司）；乙腈（色譜純，Fisher Scientific公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）。

Agilent series 1200高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器，Agilent公司）；超純水凈化儀（Millipore-Q公司）；AB135-S分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO公司）；Vortex-Genie 2渦旋震蕩器（Scientific Industries公司）；H1850臺式高速離心機（湖南湘義離心機儀器有限公司）；KH-500E超聲清洗器（中國昆山禾創超聲儀器有限公司）；有機相濾膜（尼龍，0.22 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；pH精密試紙（pH 0.5～5.0，杭州特種紙業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取50.00 mg苯甲羥肟酸標準物質，用25 mL 10%（體積比）甲醇/水溶液溶解后定容至50 mL，配制成質量濃度1000.0 μg/mL的標準儲備液，于4 ℃儲存。標準工作液：用10%（體積比）甲醇/水溶液將標準儲備液逐級稀釋配制成質量濃度0.25，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

樣品前處理方法參考文獻[12,25]，并加以改進。稱取2.00 g試樣，加入8 mL 60%（體積比）甲醇/水溶液旋渦混勻，超聲提取20 min，按4000 r/min離心3 min；取上清液過0.22 μm有機相濾膜，上機檢測，每個試驗重復3次。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；進樣體積50.0 μL；柱溫30℃；檢測波長228 nm；流動相A為甲醇，流動相B為磷酸二氫鉀溶液（pH 2.5），梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.2.4 苯甲羥肟酸質量分數的計算

式中：X為目標物質量分數，mg/kg；c為根據標準曲線計算出的目標物質量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；m為樣品質量，g；1000為換算系數。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次，采用Excel 2013進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 流動相條件優化結果

試驗以甲醇為流動相A，以水、不同pH（pH 2.0，2.5，3.0，4.0和5.0）的磷酸二氫鉀溶液分別為流動相B。采用pH精密試紙測定流動相A、B混合前后pH的變化，結果發現不同比例流動相A、B兩相混合時，混合溶液的pH幾乎不變，因此，可排除流動相A、B兩相在混合過程中因pH變化而造成目標色譜峰和雜質色譜峰保留時間的改變。

按照1.2.2小節的方法處理小麥粉樣品，取1 mL濾液，與1 mL 200 μg/mL苯甲羥肟酸標準溶液混合，上機檢測，由儀器自帶數據分析軟件計算目標物色譜峰對稱性及與雜質峰的分離度。如圖1和表3所示，以水為流動相B，苯甲羥肟酸色譜峰與樣品中雜質色譜峰存在部分交叉重合，無法達到完全分離效果（圖1a）；以磷酸二氫鉀溶液為流動相B，pH 2.0時，目標物色譜峰與雜質色譜峰幾乎完全重合（圖1 b）；pH 2.5～5.0時，隨著流動相pH增加，雜質色譜峰保留時間前移，而苯甲羥肟酸色譜峰保留時間變化較小，且其對稱性及與雜質色譜峰的分離度降低（圖1 c～f）。由此說明，最佳流動相條件是pH 2.5的磷酸二氫鉀溶液。

表3 不同流動相對苯甲羥肟酸和雜質分離的影響

圖1 小麥粉中苯甲羥肟酸在不同流動相條件下的色譜圖

2.2 提取試劑的優化結果

準確稱取2.00 g小麥粉樣品，添加10.00 μg苯甲羥肟酸，以不同體積比（0∶1，1∶9，1∶4，3∶7，2∶3，1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1和1∶0）甲醇/水混合溶液按照1.2.2的方法進行提取分析，每個處理3個平行。由表4和圖2可知，使用不同體積比混合的甲醇/水溶液進行提取時，苯甲羥肟酸回收率不同，差異極顯著（p＜0.01）。其中，采用100%甲醇或100%水進行提取時，苯甲羥肟酸回收率均低于其他比例甲醇/水混合溶液的回收率；甲醇/水體積比3∶2時，苯甲羥肟酸回收率最高，與其他比例具有顯著性差異。因此，選擇體積比3∶2的甲醇/水混合溶液作為最佳提取試劑。

表4 小麥粉中苯甲羥肟酸在不同提取試劑條件下的回收率方差分析表（α=0.01）

圖2 小麥粉中苯甲羥肟酸在不同提取試劑條件下的回收率

2.3 苯甲酸干擾排除結果

過氧化苯甲酰[26-27]是一種強氧化劑，常用作面粉處理劑，改善面粉色澤，增加面粉白度，加快面粉后熟，延長保質期，提高出粉率等。過氧化苯甲酰用于面粉漂白后會分解成苯甲酸。為排除苯甲酸對方法檢測苯甲羥肟酸的干擾，按照1.2.3小節的條件分別測定10.00 μg/mL苯甲羥肟酸標準溶液和10.00 μg/mL苯甲酸標準溶液，結果如圖3所示。在相同色譜條件下，苯甲羥肟酸色譜峰保留時間為16.10 min，苯甲酸色譜峰保留時間為25.30 min，2種物質能完成分開。由此說明，該方法中苯甲羥肟酸的檢測不會受苯甲酸干擾。

圖3 苯甲羥肟酸標準溶液（a）和苯甲酸標準溶液（b）色譜圖

2.4 方法有效性測定結果

2.4.1 方法線性范圍、檢出限和定量限結果

將0.25，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的苯甲羥肟酸系列標準工作液，按照1.2.3小節的條件進行測定，以目標物的峰面積為縱坐標，以相應濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程和相關系數。如圖4所示，苯甲羥肟酸在0.25～10.00 μg/mL范圍內線性關系良好，線性方程為y=148.65x-31.327，R2=0.9995，檢出限（LOD）為1.00 mg/kg，定量限（LOQ）為3.00 mg/kg。

圖4 苯甲羥肟酸標準曲線

2.4.2 方法精密度結果

以小麥粉陰性樣品作為空白基質，將苯甲羥肟酸按質量分數6.00 mg/kg的水平進行加標。按照1.2.3的條件測定，重復測定6次。結果發現，6次檢測結果分別為6.04，5.96，6.12，6.12，6.12和5.88 mg/kg，平均值為6.04 mg/kg，SRSD為1.7%（表5），表明該方法的精密度良好。

表5 方法精密度分析結果

2.4.3 加標回收率結果

以小麥粉陰性樣品作為空白基質，將苯甲羥肟酸按質量分數3.00，6.00和30.00 mg/kg進行3組水平加標試驗，每個水平6個平行，按照1.2.2和1.2.3的方法進行測定分析。由表6可知，小麥粉中加標水平為3.00 mg/kg時，苯甲羥肟酸回收率為91.7%～99.0%，平均回收率為94.7%，SRSD為3.2%；加標水平為6.00 mg/kg時，回收率為90.0%～95.8%，平均回收率為92.8%，SRSD為3.8%；加標水平為30.00 mg/kg時，回收率為90.7%～99.0%，平均回收率為93.3%，SRSD為3.2%。結果說明試驗方法具有較高準確度。

表6 苯甲羥肟酸加標回收率和相對標準偏差

因此，以試驗方法檢測小麥粉中苯甲羥肟酸，在0.25～10.00 μg/mL范圍內線性關系良好（R2為0.9995），回收率為90.0%～99.0%，相對標準偏差為3.2%～3.8%，檢出限（LOD）為1.00 mg/kg，定量限（LOQ）為3.00 mg/kg。

2.5 實際樣品測定

采購21份不同產地的小麥粉樣品，其中北京市、山東省、遼寧省各2份，河北省4份，河南省和新疆維吾爾自治區各3份，黑龍江省、江蘇省、湖南省、四川省、內蒙古自治區各1份。分別使用試驗方法及標準方法進行測定，結果經試驗方法測定21份小麥粉樣品，所有樣品均未檢出苯甲羥肟酸；使用標準方法進行測定，苯甲羥肟酸目標色譜峰與雜質峰無法分離。

標準BJS 202002中以甲醇為提取試劑，甲醇/0.01%磷酸為流動相，測定小麥粉及小麥粉處理劑中苯甲羥肟酸含量，檢出限為0.1 mg/kg，定量限為0.3 mg/kg。實驗室使用標準方法進行測定時發現，100%甲醇的提取效率比甲醇/水（體積比3∶2）的混合溶液提取效率低，且在標準方法的流動相條件下，苯甲羥肟酸目標色譜峰與小麥粉中的雜質色譜峰重合，無法進行苯甲羥肟酸的準確定量。與標準方法相比，試驗方法中苯甲羥肟酸含量在0.25～10.00 μg/mL范圍內線性關系良好，檢出限為1.00 mg/kg，定量限為3.00 mg/kg。雖然試驗方法的檢出限較標準方法高，但是該方法可有效分離苯甲羥肟酸色譜峰與小麥粉中的雜質峰，避免雜質峰對苯甲羥肟酸定量的干擾，具有良好的精確度和準確度。

此外，鄭紅等[12]建立液相色譜-質譜法檢測面粉改良劑中苯甲羥肟酸含量，該方法在0.005～1.000 μg/mL范圍內線性關系良好（r2＞0.999），方法檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。比較而言，雖然試驗方法的檢出限較高，但2種方法適用對象不同，試驗方法適用于小麥粉中苯甲羥肟酸含量的定量測定，而液相色譜-質譜法針對的是面粉改良劑，2種方法是否通用于小麥粉和面粉改良劑兩類樣品，還需進一步驗證。同時，試驗方法采用的液相色譜設備，價格相對便宜，普適性較高。

3 結論

針對小麥粉中可能添加的苯甲羥肟酸有毒有害物質，通過優化色譜條件、提取試劑（甲醇/水）體積比，分析苯甲酸干擾性及方法有效性等，最終建立一種可定量檢測小麥粉中苯甲羥肟酸含量的高效液相色譜法。該方法可有效分離苯甲羥肟酸與小麥粉中的雜質，具有良好的精確度和準確度，苯甲羥肟酸在0.25～10.00 μg/mL范圍內線性關系良好，檢出限為1.00 mg/kg，定量限為3.00 mg/kg。對21份不同產地的小麥粉樣品進行檢測，結果發現均未檢出苯甲羥肟酸成分。該方法前處理簡單，可操作性強，靈敏度及回收率較高，可滿足苯甲羥肟酸的定性定量檢測要求。該方法的建立為中國小麥粉的質量控制和安全監管提供技術支撐。