體外受精患者卵泡液高密度脂蛋白顆粒組分與胚胎質量的相關性分析

雷承泳，周志偉，段 彪，羅朝霞，馮 清

（贛州市人民醫院生殖醫學科，江西 贛州 341000）

卵泡液（follicular fluid，FF）為卵母細胞發育提供微環境，在卵泡生長、卵母細胞成熟和排卵等過程中發揮重要作用[1]。研究顯示[2]，卵泡液包括顆粒細胞產生的分泌物和活性成分、毛細血管擴散的血清、透過血卵泡屏障的血漿組分等成分，卵泡液成分的變化對卵泡發育和體外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎質量具有重要影響。為改善IVF 妊娠結局、減少母嬰并發癥，找到卵泡液中與胚胎質量的相關的組分用于胚胎質量的有效預測，進行選擇性單胚胎移植就顯得尤為重要。本研究以卵泡液中高密度脂蛋白（HDL）顆粒組分為切入點，探討其與卵裂期胚胎質量的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2019 年8 月-2020 年3 月在贛州市人民醫院生殖醫學科接受IVF-ET 助孕的不孕婦女為研究對象，共提取504 份卵泡液樣本。納入標準：①年齡20～40 歲，有固定配偶、未分居、規律性生活、無避孕措施、無哺乳、有生育意愿但≥12 月以上未獲得臨床妊娠；②符合《衛生部關于修訂人類輔助生殖技術及人類精子庫相關技術規范、基本標準和倫理原則》中IVF-ET的適應證，如輸卵管因素不孕、排卵障礙型不孕、子宮內膜異位癥、女性免疫性不孕或不明原因不孕[3]；③夫妻雙方情況滿足并采用常規體外受精的受精方式；④無吸煙、飲酒等不良嗜好。排除標準：①女方既往存在不良孕產史或合并生殖系統畸形、子宮內膜病變、引起宮腔形態變化的子宮腺肌病者；②女方合并甲狀腺、腎上腺、垂體等器質性病變及其他內分泌疾病影響妊娠者；③女方合并糖尿病、系統性紅斑狼瘡、急性活動性肝炎、肝硬化、急性腎炎、慢性腎功能不全等疾病者；④男女任何一方患有泌尿系統急性感染、性傳播疾病者；⑤與妊娠結局相關的染色體異常者；⑥男女任何一方具有吸毒等不良嗜好或接觸致畸量的放射線、藥物、毒品并處于作用期者；⑦男女任何一方存在精神疾病、認知功能障礙，不能正確理解研究內容者；⑧平行參加其他臨床研究者；⑨促排卵期間出現嚴重不良反應，需要退出研究或患者強烈要求退出研究者。根據胚胎質量將樣本分為優質胚胎組（n=266）和非優質胚胎組（n=238）。本研究經醫院倫理會批準，患者及配偶對研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集研究對象的年齡、體重、不孕年限、不孕因素、不孕類型、基礎FSH、基礎LH、基礎E2、基礎P、基礎PRL、Gn 量、獲卵數、受精率、卵裂率、可移植胚胎率、優質胚胎率等重要臨床資料。

1.2.2 體外受精 采用常用的早卵泡期長方案進行促排卵[4]。在月經來潮第2～3 天肌肉注射促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）［注射用醋酸亮丙瑞林微球（上海麗珠制藥有限公司，國藥準字H20093852），規格：3.75 mg/支］3.75 mg，28～30 d 后行B 超及內分泌檢查。若垂體完全降調節（子宮內膜厚度≤5 mm，血清FSH＜5 mIU/ml，LH＜5 mIU/ml，E2＜50 pg/ml），開始給予促性腺激素（Gn）［重組人促卵泡液激素注射液（默克雪蘭諾有限公司，進口藥品注冊標準JS20160044），規格：300 IU/支］75～300 IU/d 啟動超促排卵周期，5 d 后B 超監測卵泡生長大小，并監測血清激素水平，根據卵泡生長發育速度調整Gn 用量，直至HCG 注射日止。當至少有1 個卵泡直徑≥19 mm 或2 個卵泡直徑≥18 mm 時，于當晚給予HCG（默克雪蘭諾有限公司，批號：S20110045，規格：250 μg/支）250 μg 皮下注射，36 h后在陰道B 超引導下取卵。取卵過程：術前30 min肌注酮咯酸氨丁三醇注射液（山東新時代藥業有限公司，國藥準字H20052634，規格：30 mg）30 mg，排空膀胱，取膀胱截石位，用生理鹽水沖洗外陰和陰道并擦干，鋪消毒巾，在陰道探頭外罩以無菌橡膠套，安置穿刺架。用生理鹽水徹底沖洗探頭套和手術者手套，擦干，用培養液沖洗穿刺針，將探頭置入陰道內，探查兩側卵巢，連接負壓吸引器，維持負壓100～120 mmHg，采用16 G～17 G的單腔取卵針通過探頭導向器在穿刺引導線的指示下，經陰道穹窿部進針。進針前，先確認患者雙側卵巢位置、卵泡數目及大小，同時注意周圍大血管的分布，小心避開盆腔中膀胱、血管、腸管等以防止出血及其它事故的發生，由近至遠依次穿刺所有直徑≥14 mm的卵泡，每次只穿刺一個卵泡。抽取的卵泡液快速送入胚胎實驗室采集皿中，之后在顯微鏡下尋找卵泡液中的卵-冠-丘復合體，漂洗掉復合體表面附著的血液和碎片，將漂洗處理過的卵-冠-丘復合體放入提前配好的受精培養液中，然后置于6%CO2、37 ℃培養箱培養3～6 h 后進行常規體外受精。同時收集卵泡液，以1800 r/min 速度離心10 min，取上清液，分成1 ml/份在-20 ℃保存。取卵術后予以抗生素防止感染，給予黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33020828，規格：10 mg）進行黃體支持，為移植日做準備。進行治療的男方取精前2～7 d 不能同房，與女方取卵同日取精，取精前排空膀胱，洗凈雙手及尿道口，以手淫的方式將采集的精液盛放于無菌的容器中。取精日突發取精困難或存在勃起障礙影響取精者：給予心理暗示、影音刺激、配偶協助求精或口服西地那非（輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20020528，規格：100 mg），或給予直腸前列腺按摩取精，或行睪丸細針抽吸術取精[5]。收集的精液置于恒溫裝置上，待其液化后用無菌吸管吹打混勻，然后按本科室常規方案進行精液優化處理，獲取的精子懸液標本置于6%CO2、37 ℃培養箱培養1 h 左右。常規的體外受精是將卵子和精子放入同一培養皿中（根據加入的卵子數來確定加入的精子數），培養16～18 h 開始觀察卵子的受精狀況，再培養24～48 h觀察胚胎質量情況。

1.2.3 胚胎質量判定 受精后第3 天根據形態學特征對卵裂期胚胎進行質量評分，分為4 個等級[6]。1 級：胚胎細胞數為7～9 個，細胞大小均勻，形狀規則，透明帶完整；胞質均勻清晰，沒有顆粒現象；碎片比例≤5%。2 級：胚胎細胞數≥6 個，細胞大小略不均勻，形狀略不規則；胞質有顆粒現象；碎片比例占5%～20%；胞漿有1～2 個空泡存在。3 級：胚胎細胞數≥4 個，細胞大小明顯不均勻，有明顯的形態不規則；胞質有明顯顆粒現象；碎片在21%～50%；胞漿中出現少量空泡。4 級：胚胎細胞數≥2 個，細胞大小嚴重不均勻；形狀完全不規則，胞質有嚴重顆粒現象；碎片在50%以上，或50%以上的空泡。其中第3 天質量評分為1 級、2 級且細胞數為7、8、9 個，碎片比例≤10%的正常受精胚胎定義為優質胚胎。第3 天質量評分為1 級、2 級且細胞數≥6 個的正常受精胚胎定義為可移植胚胎。

1.2.4 卵泡液相關成分檢測 ①采用免疫比濁法測定載脂蛋白A1（ApoA1）和載脂蛋白B（ApoB）水平；②采用免疫印跡法[7]測定HDL 亞類，各亞類的相對百分含量再與樣品中ApoA1的含量相乘，即為HDL各亞類的含量；③采用人活性氧ELISA 試劑盒檢測活性氧（ROS）含量，采用總抗氧化能力試劑盒檢測卵泡液總抗氧化能力（TAC）水平。

1.3 觀察指標 觀察優質胚胎組和非優質胚胎組卵泡液中ApoA1、HDL 亞類水平，分析其與卵裂期胚胎質量是否存在相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0 進行統計學數據分析。計量資料采用（）表示，采用t檢驗，計數資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 相關性分析，多因素分析采用Logistic 回歸分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床資料 納入504 份卵泡液樣本，來自110例助孕患者。年齡24～37 歲，平均年齡（29.93±3.28）歲；體重指數16.36～26.67 kg/m2，平均體重指數（21.54±2.28）kg/m2；不孕年限1～9 年，平均不孕年限（2.65±1.59）年。不孕因素：盆腔輸卵管因素79例，占71.81%；不明原因不孕21例，占19.09%；排卵障礙6例，占5.45%；多囊卵巢綜合癥3例，占2.73%；男方因素8例，占7.27%。不孕類型：原發性不孕46例，占41.82%；繼發性不孕64例，占58.18%。基礎FSH（16.16±2.13）mIU/ml；基礎LH（5.83±2.12）mIU/L；基礎E2（175.34±62.55）pmol/L；基礎P（0.31±0.13）ng/ml；基礎PRL（17.61±6.10）ng/ml；Gn 量（2649.09±989.98）IU。

2.2 獲卵數及優質胚胎率 獲卵6～17 枚，平均獲卵（10.35±3.07）枚，共獲卵子1138 枚，受精1028 枚，受精率為90.33%；卵裂1018 枚，卵裂率為99.03%；可移植胚胎504 枚，可移植胚胎率為49.51%；優質胚胎266 枚，優質胚胎率為25.88%。

2.3 兩組檢查指標比較 兩組ROS、TAC、ApoA1、ApoB、preβ1-HDL、HDL3c、HDL3b、HDL3a、HDL2a、HDL2b 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組檢查指標比較（）

表1 兩組檢查指標比較（）

2.4 卵泡液中檢查指標與優質胚胎的相關性分析Spearman 相關分析顯示，卵泡液中preβ2-HDL 水平與優質胚胎無相關性（P＞0.05），卵泡液中ROS、ApoB、preβ1-HDL、HDL3c、HDL3b 水平與胚胎質量呈負相關（P＜0.05），ApoA1、HDL3a、HDL2a、HDL2b、TAC 水平與胚胎質量呈正相關（P＜0.05），見表2。

表2 卵泡液中檢查指標與胚胎質量的相關性分析

2.5 影響優質胚胎的多因素Logistic 回歸分析 將單因素分析中 ApoA1、ApoB、preβ1-HDL、HDL3c、HDL3b、HDL3a、HDL2a、HDL2b、ROS、TAC 進行自變量賦值（X1～X10，連續變量），以可移植胚胎是否為優質胚胎為因變量，進行多因素Logistic 分析，結果顯示ApoA1、HDL2b、ApoB 為胚胎質量的影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 影響優質胚胎的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

目前ART的臨床實踐中已經建立了多種胚胎質量評估的方法，包括形態學、代謝組學和基因組學等[8]。卵泡液是卵母細胞發育的重要環境，其成分包括血液透過血卵泡屏障的血漿成分、顆粒細胞和顆粒細胞產生的分泌物和活性成分等，與外周血液相比較，卵泡液與卵母細胞的聯系更為緊密，可直接影響卵母細胞的發育過程和受精能力，卵泡液成分的變化直接影響卵母細胞的形態和胚胎質量[9]。

氧對于細胞的生存至關重要，但正常氧代謝產生的活性氧水平升高可損傷DNA、蛋白質和脂質，從而影響細胞功能。機體內對抗ROS的總能力稱為TAC，包括各種抗氧化分子和抗氧化酶系統，正常情況下卵泡內氧化和抗氧化體系處于動態平衡，如果抗氧化物減少和（或）ROS 增多，則可導致卵泡內ROS 過度積累，產生氧化應激反應，影響卵泡發育和卵母細胞質量。Várnagy á 等[10]研究顯示，IVF 過程中卵母細胞受精率降低與TAC 降低有關。有研究證實[11]，退化的卵母細胞中ROS的積累增加，導致了包括DNA、蛋白和脂質的氧化損傷，最終誘導了細胞周期停滯及減數分裂中非整倍體的產生。Liu Y等[12]發現多囊卵巢患者較輸卵管因素不育患者的大多數卵不具備減數分裂紡錘體，ROS 水平高而TAC水平低，受精率、優質胚胎形成率、臨床妊娠率隨之下降。但研究顯示[13]，卵泡TAC 水平與妊娠結局參數無明顯影響。Yilmaz N 等[14]報道中顯示非妊娠組卵泡液中TAC 水平高于妊娠組。本研究雖然觀察到優質胚胎組ROS 降低和TAC 水平升高，但多因素分析的結果并未觀察到ROS 和TAC 與胚胎質量的相關性，這樣的結果可能與患者個體差異、研究方法和樣本數等有關，但同時也提示可能存在其他的影響因素，還需要進一步研究探討。

HDL 是復雜的多功能蛋白復合體，多數研究集中于心血管領域，而生殖領域缺乏相關研究。Rincón JAA 等[15]闡述了HDL 作為FF 中占主導地位的脂蛋白，其具有促進膽固醇逆轉運的生理功能，有助于維持卵泡液中膽固醇平衡，對卵母細胞和胚胎的發育起著重要作用，同時HDL 還具有抗炎和抗氧化活性，其抗氧化活性與脂質組合物、載脂蛋白ApoA1、結構修飾等相關。該研究的結果表明卵泡液中的ApoA1 水平與胚胎的卵裂率無關，但與胚胎的碎片化呈負相關，影響胚胎發育質量。既往研究數據顯示[16]，卵泡液中HDL 及其組成脂蛋白ApoA1 可能對人類卵母細胞質量及隨后的早期胚胎發育起保護作用，同時ApoA1 還與空卵泡刺激綜合征的低發生率相關。HDL組分中的ApoA1 還通過促進膽固醇和磷脂從外周組織轉移到新生盤狀HDL，激活卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶（LCAT），LCAT 是膽固醇酯化和最終HDL 顆粒成熟必需的酶，在HDL 重塑中發揮關鍵作用[17]。LCAT 催化膽固醇酯化，使小顆粒preβ1-HDL 轉變為HDL3，然后進一步轉變為成熟球狀大顆粒HDL2。ApoA1 含量增加時，會降低小顆粒的亞類preβ1-HDL 水平，使大顆粒的亞類增加，尤其大顆粒的HDL2b 增加最為明顯。ApoA1 作為HDL的關鍵蛋白組分，在HDL 結構重塑和抗氧化特性中發揮主要作用，HDL 功能的實現與ApoA1密不可分，卵泡液中ApoA1 可能對人類卵母細胞質量及隨后的早期胚胎發育中起保護作用。

綜上所述，HDL 顆粒組分ApoA1、HDL2b 含量水平與IVF 卵裂期胚胎質量相關，對卵裂期胚胎質量具有一定的預測價值，其具體作用機制尚不清楚，且缺少相關基礎研究，需進一步的研究探討。