肝細胞癌組織中PREX2的表達及其與患者預后的關系

王亞敏 鄭 揚 陳旭峰 向正國

肝細胞癌(HCC)是常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率和病死率均較高[1]。HCC的惡性程度較高，大多數患者在就診時已發生遠端轉移，錯過了最佳治療時機，導致患者的預后較差[2-4]。近年來，隨著HCC診療技術的發展，HCC預后有一定改善，但患者5年生存率仍較低，約為26%[5]。因此，進一步探究HCC的發病機制，尋找效能較高的生物標志物以評估患者預后，對于改善HCC的預后情況具有重要意義[6]。

磷脂酰肌醇-3, 4, 5-三磷酸依賴性Rac交換子2(PREX2)是一種鳥氨酸交換因子，可表達于大多數惡性腫瘤中，如腦膠質瘤[7]、黑色素瘤[8]、非小細胞肺癌[9]、胰腺癌[10]等。近年來研究發現，PREX2在HCC組織中表達上調，且參與了HCC細胞的增殖和遷移過程[11]。本文探究了PREX2與HCC患者預后的關系，以期為改善HCC患者的預后情況提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2012年2月至2015年5月在中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院就診的104例HCC患者作為研究對象。參照《原發性肝癌規范化診治專家共識》[3]診斷HCC。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)Child-Pugh分級為A級或B級；(3)能夠配合完成相應的檢查和隨訪；(4)HCC組織標本(活體組織病理檢查時獲取)保存完好。排除標準：(1)預計生存時間短于3個月；(2)HCC復發患者；(3)隨訪失聯；(4)合并其他惡性腫瘤。104例HCC患者中，男性63例，女性41例，年齡38～70歲，平均年齡為(61.82±6.61)歲。本研究所有受試者均簽署了知情同意書，且本研究經醫院醫學倫理委員會批準(批件號：201205052)。

1.2 信息收集

收集所有受試者的年齡、性別、Child-Pugh分級、乙肝表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤分期、腫瘤數量、腫瘤直徑及治療方案等臨床資料。隨訪起始時間為確診時間，采用復診和電話隨訪的方式了解HCC患者預后生存情況，每3個月隨訪1次，為期5年，隨訪截至2020年5月28日或患者死亡。

1.3 HCC組織中PREX2水平檢測

采用蛋白質印跡法檢測HCC組織中PREX2的蛋白表達水平。具體步驟：(1)無菌環境下研磨HCC組織，滴加RIPA裂解液提取組織中總蛋白；(2)采用BCA法檢測蛋白濃度；(3)配制10% SDS-PAGE分離膠，每孔30 μg總蛋白上樣；(4)120 V電壓下電泳，直至溴酚藍跑出膠面；(5)300 mA電流下轉膜2 h，然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；(6)滴加一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫下孵育1 h；(7)TBS緩沖液洗膜，使用ELC發光液顯影。應用ImageJ軟件讀取實驗結果。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 生存組和死亡組PREX2的表達水平比較

104例HCC患者在隨訪期間有42例(40.38%)發生死亡。根據HCC患者的預后生存情況將其分為死亡組(n=42)和生存組(n=62)。死亡組PREX2蛋白的相對表達量為0.60±0.12，高于生存組(0.42±0.07)，兩組差異有統計學意義(t=9.313，P<0.001)，見圖1。

圖1 兩組PREX2的表達水平比較 A 生存組 B 死亡組

2.2 兩組生存情況的比較

PREX2預測HCC患者預后的ROC曲線下面積(AUC)、最大約登指數、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.915(95%CI：0.843～0.960)、0.729、0.49、80.95%和91.94%，見圖2。根據PREX2預測HCC患者預后的最佳截斷值將其分為低表達PREX2組(n=65)和高表達PREX2組(n=39)。低表達PREX2組的中位生存時間為60個月，長于高表達PREX2組(25個月)，兩組差異有統計學意義(log-rankχ2=72.646，P<0.001)，見圖3。

圖2 PREX2預測HCC患者預后的ROC曲線

圖3 低表達PREX2組和高表達PREX2組的生存曲線

2.3 影響HCC患者預后的相關因素

將可能與HCC患者預后生存有關的因素，如年齡、性別、Child-Pugh分級、HBsAg、AFP、腫瘤數量、腫瘤直徑、腫瘤分期、治療方案和PREX2作為自變量，將HCC患者的預后生存情況作為因變量，納入Cox單因素回歸分析，結果顯示年齡、Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤分期和PREX2與HCC患者預后生存有關(P<0.05)。將年齡、Child-Pugh分級、腫瘤直徑、腫瘤分期和PREX2作為自變量，將HCC患者的預后情況作為因變量，納入Cox多因素回歸分析，結果顯示年齡、Child-Pugh分級、腫瘤分期和PREX2均是HCC患者預后生存的獨立危險因素(P均<0.05)，見表1。

表1 影響HCC患者預后的單因素和多因素Cox比例風險回歸分析

2.4 PREX2與HCC患者預后生存的關系

采用限制性立方樣條擬合Cox比例風險回歸模型分析PREX2與HCC患者預后生存的關系。當節點個數為3時，AIC值最小(AIC=309.521)。結果顯示，PREX2與HCC患者的預后生存有關(χ2=43.86，P<0.001)，且呈非線性關系(χ2=4.54，P=0.033)。以PREX2預測HCC患者預后生存的最佳截斷值作為分界點，當PREX2<0.49時，HCC患者預后發生死亡的風險降低；當PREX2>0.49時，HCC患者預后發生死亡的風險升高，見圖4。

圖4 PREX2與HCC患者預后的限制性立方樣條圖

3 討論

近年來有多項研究指出，PREX2可參與HCC的發病及進展過程[11]，但有關其與HCC患者預后關系的報道較少。本研究比較了生存組與死亡組PREX2蛋白的表達水平，結果發現死亡組PREX2蛋白水平高于生存組，這提示PREX2可能與HCC患者的預后生存有關。

本研究結果表明，PREX2預測HCC患者預后生存的效能較高，檢測其水平有助于臨床醫師及時了解患者的預后情況，從而制定有針對性的治療方案。HCC患者的年齡、Child-Pugh分級和腫瘤分期與預后關系密切。范維等[12]研究表明，年齡較大、腫瘤分期為Ⅲ～Ⅳ期是HCC患者預后不良的獨立危險因素。賈春麗等[13]研究表明，HCC患者的年齡、Child-Pugh分級和腫瘤分期均是預后的獨立危險因素。本研究Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，年齡、Child-Pugh分級和腫瘤分期均是HCC患者預后的獨立危險因素，與上述研究結果相符。此外，本研究結果還顯示PREX2亦是HCC患者預后的獨立危險因素。Yang等[14]研究顯示，HCC患者中PREX2的表達水平較高，且在68例HCC患者中檢測到有16例患者至少攜帶一種PREX2基因突變，該研究表明PREX2基因突變可導致蛋白質變性，促進細胞增殖，從而促進HCC進展。Li等[15]研究表明，PREX2蛋白在54.9%的人類 HCC樣本中表達上調，且其表達水平越高提示患者生存率越低；同時，該研究表明甘氨酸 N-甲基轉移酶可通過促進PREX2的降解，參與蛋白激酶B信號轉導通路表達和HCC的發生。體外研究證實，敲低PREX2的表達可降低HCC細胞的侵襲能力[16-17]。上述研究結果均表明，PREX2在HCC組織中表達水平較高，可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，進而影響患者的預后。

綜上所述，HCC組織中PREX2的表達水平與患者的預后有關，其表達水平越高提示患者的生存率越低。因此，檢測HCC組織中PREX2的表達水平有助于評估患者的預后情況。本研究尚存在一定不足，如樣本量偏小，且是單中心研究，致使實驗結果可能存在一定選擇偏倚。今后，本課題組將進一步探究PREX2影響HCC患者預后的病理、生理機制，為HCC治療靶點的選擇提供參考。