急性胰腺炎患者血漿miR-25-3p的表達水平與預后的關系

段昕妤 董紅艷 吳 凱

急性胰腺炎(AP)是一種常見的消化系統疾病，其發病機制主要是胰酶異常激活誘發自身炎性反應，具有起病急、進展快、并發癥多、病死率高等特點[1-3]。近年來，在中國AP的發病率呈逐年升高趨勢[4]。早期對AP患者進行有效干預并評估其預后情況可提高治療有效率，降低患者病死率。目前，臨床尚缺乏準確度較高的指標用以評估AP患者的預后情況。因此，尋找有效預測AP預后的指標具有重要意義。

miRNA是一種由18～24個核苷酸構成的單鏈RNA，不具備編碼蛋白質功能，可參與細胞的增殖、凋亡、自噬等過程[5-6]。研究報道，miR-25-3p可通過調節自噬相關基因(ATG)14-Beclin1，促進多囊腎小鼠的腎細胞增殖并抑制其自噬[7]。自噬在AP發病和進展過程中起著關鍵作用[8]。此外，自噬通量不足與機體炎性反應程度加重有關[9]。由此推測，miR-25-3p可通過調節自噬參與AP的發病和進展過程，檢測其水平或可了解AP患者的預后情況。本文探究了AP患者血漿miR-25-3p的表達水平與預后的關系，以期為AP患者的預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年4月至2020年7月中國人民解放軍總醫院第八醫學中心收治的325例AP患者作為研究對象。納入標準：(1)根據《中國急性胰腺炎診治指南(2019年，沈陽)》[4]診斷為AP；(2)年齡18～70歲；(3)發病24 h內入院；(4)簽署了知情同意書。排除標準：(1)伴有感染性疾病，如病毒性肝炎等；(2)伴有惡性腫瘤；(3)伴有心臟疾病，如冠心病、擴張性心肌病等；(4)伴有自身免疫性疾病或長期服用免疫抑制劑。325例AP患者中，男性221例，女性104例，年齡25～69歲，平均年齡為(47.52±7.59)歲；其中酒精性AP有36例，膽源性AP有184例，高脂血癥性AP有105例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準(批件號：309202103031013)。

1.2 臨床信息收集

收集入組受試者的年齡、性別、BMI、AP病因、急性生理與慢性健康評分Ⅱ(APACHE Ⅱ)、急性胰腺炎嚴重程度床邊指數(BISAP)及入院28 d的生存情況。應用DxH 600血細胞分析儀[購自貝克曼庫爾特實驗系統(蘇州)有限公司]檢測患者入院24 h內白細胞計數(WBC)，采用免疫比濁法檢測C反應蛋白(CRP)，采用速率法檢測脂肪酶、淀粉酶水平，采用雙抗體夾心法檢測乳酸水平。

1.3 miR-25-3p水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測血漿miR-25-3p水平[10]。抽取AP患者入院24 h內(T0期)、治療1 d(T1期)和治療5 d(T2期)時的肘部靜脈血10 mL，離心后取上層清液，置于-80 ℃冰箱中待驗。使用TRIzol試劑(購自日本TaKaRa公司)提取血漿中總RNA，使用反轉錄試劑盒(購自日本TaKaRa公司)將RNA反轉錄為cDNA，然后使用PCR儀[購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]擴增cDNA，擴增條件為95 ℃預變性5 min，之后95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共計35個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-25-3p的相對表達量，ΛCt=CtmiR-25-3p-CtU6。以U6作為內參，引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 miR-25-3p水平的動態變化

根據AP患者入院后28 d的生存情況將其分為生存組(n=269)和死亡組(n=56)。生存組治療前(T0期)、治療1 d(T1期)和治療5 d(T2期)的miR-25-3p相對表達量分別為0.37±0.05、0.45±0.10和0.72±0.13；死亡組T0期、T1期和T2期的miR-25-3p相對表達量分別為0.29±0.04、0.37±0.08和0.57±0.17。整體分析，兩組T0期、T1期和T2期的miR-25-3p差異有統計學意義(F時間=12.598，F空間=13.514，F交互=12.854，P<0.05)。與死亡組比較，生存組T0期、T1期和T2期miR-25-3p的相對表達量均較高(t=10.925、5.741、6.472，P均<0.05)。組內比較，生存組不同時期miR-25-3p水平差異有統計學意義(P<0.001)，死亡組不同時期miR-25-3p水平差異亦有統計學意義(P<0.001)，兩組miR-25-3p的表達水平隨治療時間延長均呈升高趨勢，但兩組的升高幅度不同，生存組miR-25-3p表達水平的升高幅度大于死亡組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：*P<0.05圖1 生存組和死亡組miR-25-3p表達水平的動態變化圖

2.2 miR-25-3p預測AP患者預后的價值

T0期miR-25-3p預測AP患者預后的ROC曲線下面積(AUC)、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.891(95%CI：0.853～0.929)、0.33、91.07%和74.72%；T1期miR-25-3p預測AP患者預后的AUC、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.757(95%CI：0.694～0.820)、0.41、76.79%和66.17%；T2期miR-25-3p預測AP患者預后的AUC、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.767(95%CI：0.690～0.844)、0.56、55.36%和90.33%。結果表明，T0期miR-25-3p預測AP患者預后的AUC分別大于T1期miR-25-3p和T2期miR-25-3p，差異均有統計學意義(Z=3.699，P<0.001；Z=2.775，P=0.006)。見圖2。

圖2 miR-25-3p預測AP患者預后的ROC曲線

2.3 生存組和死亡組的臨床病理特征比較

生存組和死亡組在年齡、性別、BMI、病因、WBC和淀粉酶方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。與死亡組比較，生存組APACHEⅡ評分、BISAP評分、CRP、脂肪酶和乳酸水平均較低，兩組差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組的臨床病理特征比較

2.4 影響AP患者預后的因素

將AP患者入院28 d的生存情況作為因變量，將單因素分析結果中P<0.1的因素(包括APACHEⅡ評分、BISAP評分、CRP、脂肪酶、乳酸和T0期miR-25-3p)作為自變量納入多因素logistic回歸分析。因T0期miR-25-3p的AUC較大，預測效能較高，故僅納入T0期miR-25-3p作為自變量。結果顯示，APACHEⅡ評分、BISAP評分、CRP和乳酸是AP患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，T0期miR-25-3p是AP患者預后的獨立保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響AP患者預后的多因素logistic回歸分析

2.5 預后模型的構建及評價

采用多因素logistic回歸模型分析法構建評估AP患者預后的模型A(由APACHEⅡ評分、BISAP評分、CRP和乳酸組成)和模型B(由APACHEⅡ評分、BISAP評分、CRP、乳酸和T0期miR-25-3p組成)，模型A公式：F=-18.155+0.609×APACHEⅡ評分+2.156×BISAP評分+0.107×CRP+1.225×乳酸，模型B方程F=-22.314+0.798×APACHEⅡ評分+2.842×BISAP評分+0.342×CRP+1.232×乳酸-5.115×T0期miR-25-3p。模型A評估AP患者預后的AUC、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.936(95%CI：0.907～0.964)、0.16、87.50%和84.39%；模型B評估AP患者預后的AUC、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.980(95%CI：0.963～0.998)、0.21、96.43%和95.91%。結果表明，模型B評估AP患者預后的AUC大于模型A，差異有統計學意義(Z=3.265，P=0.001)。見圖3。模型A和模型B的校準曲線均接近理想曲線，見圖4。當閾值概率>5%時，模型B評估AP患者預后的凈收益高于模型A，見圖5。

圖3 模型A和模型B評估AP患者預后的ROC曲線

圖4 模型A和模型B的校準曲線 A 模型A B 模型B

圖5 模型A和模型B的風險效益決策曲線

3 討論

在中國，AP患者的病死率為5%～10%[11]。若能早期評估患者的預后情況，及時給予針對性治療，可大幅降低病死率。目前用于評估AP患者預后情況的指標包括血清前白蛋白、紅細胞分布寬度、鈣結合蛋白S100A12、Ranson評分、APACHEⅡ評分和SOFA評分等，上述指標均被證實與AP的預后存在一定關系，但單獨用于評估AP患者的預后均存在一定不足，如敏感度較低、特異度較低等[12-14]。本文探究了AP患者血漿miR-25-3p水平與預后的關系，以期為AP的預后評估提供更多參考指標。

有研究報道，miR-25-3p參與了胃癌、心肌梗死和慢加急性肝衰竭等的發展過程[15-17]。另有研究表明，miR-25-3p對于前列腺癌、非小細胞肺癌的診斷和預后具有一定價值[18-19]。本研究觀察了AP患者血漿miR-25-3p水平的動態變化，結果顯示生存組和死亡組miR-25-3p水平隨治療時間延長均呈上升趨勢，生存組T0期、T1期和T2期的miR-25-3p水平均高于死亡組，上述結果提示miR-25-3p與AP進展有關，其水平或可用于AP的預后評估。本研究構建了miR-25-3p評估AP預后的ROC曲線，結果顯示T0期miR-25-3p評估AP患者預后的AUC和敏感度均較高，但特異度偏低，這提示T0期miR-25-3p對于AP的預后評估具有一定價值，其可輔助評估AP預后。鑒于T0期miR-25-3p單指標評估AP預后的不足，本研究進一步構建了評估AP預后的模型A和模型B，結果顯示模型B的評估效能高于模型A，且模型B的校準曲線接近理想曲線，這提示模型B對于AP患者的預后評估具有較高價值。

APACHEⅡ評分和BISAP評分是評價AP嚴重程度和預后的重要參考指標，多用于評估重度AP患者預后[20-22]。多項研究表明，APACHEⅡ評分和BISAP評分與AP患者發生預后不良有關[23-24]。本研究結果顯示，APACHEⅡ評分、BISAP評分、CRP和乳酸是AP患者預后的獨立危險因素，T0期miR-25-3p是AP患者預后的獨立保護因素。有研究報道，受轉錄因子激活蛋白-2α(AP-2α)正向調節的miR-25-3p可通過靶向Akt1基因參與代謝反應[25]；Akt抑制劑可通過抑制腺泡再生，促進腺泡至導管化生的進展，下調AP小鼠的炎性反應程度[26]。由此推測，miR-25-3p可能通過調節Akt1表達，抑制炎性反應，從而改善患者預后，但具體機制有待深入探究。

綜上所述，AP患者血漿miR-25-3p的表達水平與預后關系密切，基于miR-25-3p構建的模型對于評估AP患者的預后情況具有一定價值。本研究的局限性在于樣本量偏少，后續將開展大樣本研究進一步分析模型B評估AP預后的價值及可行性。