干擾ECT2基因表達對結直腸癌SW620細胞侵襲和遷移的影響及機制研究

李索妮 李麗娜 馬婕群 鄭 琪 張彥兵 翟 陽 周 菁

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，也是全球腫瘤相關死亡的主要原因之一[1]。在西方發達國家中，結直腸癌是發病率僅次于肺癌的第2位惡性腫瘤，近年來中國結直腸癌的發病率迅速升高[2]。目前臨床上雖已對結直腸癌的常規治療方法(包括外科手術)進行了改進，但仍有超過三分之一的患者發生了轉移[3]。研究表明結直腸癌形成過程與促癌基因的激活及抑癌基因的失活密切相關[4]。因此，探尋更多新的生物標志物有助于開發預防和治療結直腸癌的新方法。上皮細胞轉化序列2(ECT2)基因在進化上高度保守，研究表明ECT2在多種惡性腫瘤(包括非小細胞肺癌和乳腺癌等)中表達上調[5-6]。近年來研究顯示，ECT2的異常表達與腫瘤患者的總生存期及預后等密切相關[7]。有研究報道ECT2在結直腸癌組織中呈高表達，且與腫瘤的大小及TNM分期有關[8]。然而，ECT2在結直腸癌發生和發展中的作用及機制方面鮮見報道。本實驗探究了ECT2基因對人結直腸癌SW620細胞侵襲和遷移的影響，以期為ECT2基因作為結直腸癌治療的新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人結直腸癌細胞株SW620(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清、RPMI-1640培養基、Matrigel基質膠(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Sigma公司)；ECT2特異性siRNA及非特異性siRNA(上海吉瑪生物有限公司)；脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑、TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；8 μm孔徑的Transwell小室(美國Millipore公司)；鼠抗人ECT2、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(美國CST公司)；反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；SYBR Green qPCR Master Mix檢測試劑盒、超敏ECL化學發光檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；蛋白提取試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京中科瑞泰生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養

人結直腸癌SW620細胞常規復蘇后置于RPMI-1640培養液(含10%胎牛血清)中，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養箱中孵育，使用顯微鏡觀察細胞生長狀態，每2～3 d更換新鮮培養液。待細胞生長匯合度達90%以上時，用胰蛋白酶消化細胞，按照1︰3的比例進行傳代。

1.3 SW620細胞的轉染和分組

將生長狀態良好的SW620細胞以5×104個/孔的密度接種到6孔板中，置于37 ℃培養箱中常規培養，待細胞貼壁后匯合度為50%～60%時進行轉染。根據脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑說明書，將ECT2特異性siRNA或非特異性siRNA轉染至SW620細胞，分別記為si-ECT2組和si-NC組。將未行轉染的SW620細胞作為空白對照，記為Control組。轉染后將各組細胞置于37 ℃培養箱中培養48 h，分別收集各組細胞以備相關指標檢測。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測ECT2 mRNA的表達水平

使用TRIzol試劑分別提取各組結直腸癌SW620細胞中的總RNA，按照反轉錄說明書將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，以β-actin為內參，使用SYBR Green qPCR Master Mix檢測試劑盒進行實時熒光定量PCR(real-time qPCR)檢測。反應條件為：94 ℃預變性5 min；隨后94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因ECT2的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 ECT2、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平檢測

采用蛋白質印跡法(Western blotting)檢測 ECT2、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平。使用蛋白提取試劑盒分別提取各組SW620細胞中總蛋白，以BCA法進行蛋白定量分析，蛋白與緩沖液混合于沸水中煮沸10 min使蛋白變性。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，取等量蛋白進行上樣，行電泳分離蛋白，以濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，置于5%脫脂牛奶中封阻2 h，加入相應稀釋的一抗(ECT2以1∶800稀釋，MMP-2和MMP-9均以1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，洗滌后再加入以1∶3 000稀釋的二抗，室溫下孵育2 h，采用ECL發光顯影，使用Gel Doc凝膠成像儀觀察并采集圖像，應用Quantity One圖像分析軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH作為內參，分別計算各組SW620細胞中ECT2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平。

1.6 Transwell侵襲實驗檢測SW620細胞的侵襲能力

以無血清的RPMI-1640培養液稀釋Matrigel基質膠，取50 μL稀釋的Matrigel膠均勻涂抹在Transwell小室的上室，37 ℃培養箱中放置30 min以形成基底膜。收集各組SW620細胞，以無血清培養液重懸細胞，制成濃度為1×105個/mL的細胞懸液。取100 μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，取600 μL含10%胎牛血清的培養液加入到Transwell小室的下室，置于37 ℃培養箱中常規培養48 h。以4%多聚甲醛固定Transwell小室濾膜20 min，以0.1%結晶紫染色20 min，用PBS洗去染液，晾干，在顯微鏡下隨機選取5個視野觀察并計數穿膜細胞數(取平均值)，以穿膜細胞數表示各組SW620細胞的侵襲能力。

1.7 劃痕愈合實驗檢測SW620細胞的遷移能力

將各組SW620細胞以5×104個/孔的密度接種到6孔板中，置于37 ℃培養箱中常規培養，待細胞生長匯合度達90%以上時，使用滅菌的槍頭在6孔板中劃線(呈直線)，用PBS洗去劃下的細胞，重復洗滌1次，向每孔細胞中加入不含血清的培養液，置于37 ℃培養箱中培養，分別在0 h和48 h拍照并測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率[劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 各組SW620細胞中ECT2的mRNA和蛋白表達水平比較

real-time qPCR和Western blotting法檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-ECT2組SW620細胞中ECT2 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)；而Control組與si-NC組之間的差異則均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1和表2。

圖1 Western blotting法檢測各組SW620細胞中ECT2蛋白表達水平

表2 各組SW620細胞中ECT2的mRNA和蛋白表達水平比較()

2.2 各組SW620細胞的侵襲能力比較

Transwell侵襲實驗結果顯示，與si-NC組[(96.48±9.10)個]相比，si-ECT2組SW620細胞的穿膜細胞數量[(41.36±4.26)個]明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；而Control組[(102.05±10.24)個] 與si-NC組之間的差異則無統計學意義(P>0.05)。該結果提示，干擾ECT2基因的表達可抑制SW620細胞的侵襲能力。

2.3 各組SW620細胞的劃痕愈合率比較

劃痕愈合實驗結果顯示，與si-NC組[(50.65±4.36)%]相比，si-ECT2組SW620細胞的劃痕愈合率[(26.75±3.02)%]明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；而Control組[(52.17±4.06)%]與si-NC組之間的差異則無統計學意義(P>0.05)。該結果提示，干擾ECT2基因的表達可抑制SW620細胞的遷移能力。

2.4 各組SW620細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較

Western blotting法檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-ECT2組SW620細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)；而Control組與si-NC組之間的差異則均無統計學意義(P均>0.05)。該結果提示，干擾ECT2基因的表達可抑制SW620細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達。見圖2和表3。

圖2 Western blotting法檢測各組SW620細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

表3 各組SW620細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平比較()

3 討論

結直腸癌是常見的惡性腫瘤，近年來年輕人群的結直腸癌發病率呈上升趨勢[9]。結直腸癌的治療方法雖已取得了很大進步，包括手術聯合放射治療和化學治療，但復發和遠處轉移導致患者的5年生存率較低，預后較差。目前研究顯示，結直腸癌的發生、發展與多種表觀遺傳學變化及基因改變相關[10]。因此，亟需尋找轉移相關基因并確定其在結直腸癌發生、發展中的作用機制，以便獲取可靠的生物標志物，為結直腸癌的診療提供新靶點。ECT2基因是一種鳥嘌呤核苷酸交換因子，其參與了GTP和GDP的轉換，在腫瘤中扮演促癌基因的角色。研究顯示，ECT2能影響腫瘤的惡性轉型，以及細胞生長、侵襲和轉移等多種生物學功能[11]。Shi等[12]的研究顯示，ECT2在肺癌組織中呈高表達，并且ECT2表達與肺癌患者的總生存期及無復發生存期呈負相關。乳腺癌細胞中ECT2的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于乳腺上皮細胞，沉默ECT2基因可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，并促進細胞凋亡[13]。人前列腺癌組織中ECT2蛋白表達水平升高，其與臨床病理參數、臨床分期、腫瘤侵襲和淋巴結轉移等指標呈正相關[14]。胃癌組織中ECT2表達水平升高，可通過調節上皮間質轉化促進胃癌轉移[15]。有研究顯示，ECT2表達水平升高提示結直腸癌患者的預后不良[16]。然而，目前關于ECT2對結直腸癌細胞侵襲和遷移的影響及作用機制尚不清楚，本實驗就此進行了探究。

本實驗以結直腸癌SW620細胞為研究對象，在SW620細胞中轉染ECT2特異性siRNA，結果顯示ECT2 siRNA能有效干擾SW620細胞中ECT2基因的表達。Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗結果顯示，轉染ECT2 siRNA能明顯減少SW620細胞的穿膜細胞數量并降低劃痕愈合率。結果提示干擾ECT2基因的表達可抑制SW620細胞的侵襲和遷移能力，該結論與乳腺癌、肺癌相關研究的結論相似[17-18]。

MMP是一類可降解細胞外基質中多種成分的蛋白酶家族，其主要功能是破壞腫瘤侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲和轉移中發揮了關鍵作用[19]。MMP-2和MMP-9是MMP家族的重要成員，在腫瘤侵襲和遷移方面被研究得較多。研究顯示，MMP-2和MMP-9在結直腸癌中呈高表達，可增強結直腸癌的遷移、侵襲能力[20]。本實驗采用Western blotting法檢測SW620細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平，結果顯示干擾ECT2基因的表達能夠下調MMP-2和MMP-9蛋白的表達，這提示干擾ECT2基因的表達可能通過下調MMP-2和MMP-9的表達抑制SW620細胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，本實驗結果證實了ECT2基因參與了結直腸癌的發生和發展，通過轉染特異性siRNA干擾ECT2基因的表達能夠抑制SW620細胞的侵襲和遷移能力，作用機制可能與調控MMP-2和MMP-9的蛋白表達有關。本實驗初步探究了ECT2基因對結直腸癌細胞侵襲和遷移的影響及可能的作用機制，后續將深入探究具體的作用機制。本研究尚存在不足之處，ECT2上游可能相關的miRNA和下游相關信號通路有待后續實驗探究。本實驗結果提示ECT2基因可能在結直腸癌靶向治療中具有一定的臨床價值。