過表達Prx5對四氯化碳誘導的肝纖維化模型大鼠的作用及機制研究

王 春 陳麗康 王才黨

肝纖維化是由非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、慢性乙型肝炎病毒或慢性丙型肝炎病毒感染所引發的一種以肝細胞外基質過量沉積、纖維結締組織增生為病理特征的疾病[1-3]。肝纖維化患者若不及時給予救治，隨病程進展易發展為肝硬化，甚至導致肝細胞癌，嚴重威脅人們的生命健康[4]。探尋抑制肝纖維化進展的藥物及作用靶點對其治療方案的選擇有重要意義。過氧化物酶5(Prx5)可以調控氧化應激和AMP激活的蛋白激酶途徑，改善由高脂飼料飼養誘導的非酒精性脂肪性肝病[5]。近年來有研究指出，過表達Prx5可通過抑制信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)的活化，改善由轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的大鼠腎纖維化[6]。目前關于Prx5對肝纖維化的作用的報道較少。本文探究了過表達Prx5對由四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化模型大鼠的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只SD大鼠，SPF級，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司[實驗動物許可證號SCXK(京)2009-0004]，雌雄各半。所有大鼠于(23±2)℃、60%濕度的環境下適應性飼養1周，晝夜交替間隔為12 h，期間給予充足的水和普通飼料。

1.2 試劑和儀器

CCl4、4%多聚甲醛、梯度乙醇均購自武漢博士德生物工程有限公司，BCA蛋白定量測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，抗Prx5、TGF-β1及STAT3抗體均購自北京孚博生物科技有限公司，H-E染色試劑盒及Masson染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，1658001型垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司，DYCP-31C型瓊脂糖水平電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，JXFSTPRP-Ⅱ-02型組織研磨機購自上海凈信實業發展有限公司。引物由南京善本生物科技有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 肝纖維化大鼠模型的構建及分組

從40只SD大鼠中隨機抽取10只作為對照組，給予腹腔注射橄欖油處理。另外30只大鼠給予腹腔注射含40% CCl4的橄欖油溶液處理，注射劑量為2 mL/kg，每周2次，持續6周[7]。采用H-E染色法判斷肝纖維化大鼠模型是否造模成功。初始給藥4周后，將30只大鼠隨機分為模型組、空載體組和過表達Prx5組，每組10只?？蛰d體組每周經尾靜脈注射含空載質粒的慢病毒1次，過表達Prx5組每周經尾靜脈注射含過表達Prx5質粒的慢病毒1次，持續2周。采用實時熒光定量PCR法檢測過表達Prx5是否成功。

1.4 肝臟組織中羥脯氨酸水平檢測

所有大鼠在飼養7周后，使用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死，取其肝臟組織。使用組織研磨機研磨肝臟組織，獲取組織勻漿。采用ELISA法檢測各組大鼠肝臟組織中羥脯氨酸的表達水平，試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.5 H-E染色和Masson染色

取部分肝臟組織，使用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，然后脫蠟處理，使用梯度乙醇進行水化。采用H-E染色法觀察肝臟組織的病理變化，采用Masson染色法觀察肝臟組織的膠原纖維沉積情況[8-9]。

1.6 Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠肝臟組織中Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA的表達水平[10]。取1.4步驟中的肝臟組織勻漿，室溫環境下3 500 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm。取離心后上清液，滴加至總RNA提取試劑盒(購自瑞士羅氏公司)中提取總RNA，并用722型紫外分光光度計(上海光學儀器五廠有限公司)檢測其純度。取2 μg總RNA置于反轉錄試劑盒(購自瑞士羅氏公司)中進行反應，然后將反應產物置于PTC-200型PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)中進行擴增，擴增條件為95 ℃預變性10 min，之后95 ℃ 30 s、55 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s，共40個循環。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.7 Prx5、TGF-β1和STAT3蛋白水平檢測

采用蛋白質印跡法檢測Prx5、TGF-β1和STAT3的蛋白水平[11]。取部分肝臟組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，120 V電壓下電泳100 min，200 mA電流轉膜90 min，加脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min，加二抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次10 min，曝光顯影，應用ImageJ軟件分析光密度。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟組織羥脯氨酸水平比較

對照組、模型組、空載體組和過表達Prx5組大鼠肝臟組織中羥脯氨酸的表達水平分別為(0.26±0.05)μg/mg、(0.74±0.13)μg/mg、(0.71±0.12)μg/mg和(0.38±0.09)μg/mg。與對照組比較，模型組羥脯氨酸的表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組和空載體組比較，過表達Prx5組羥脯氨酸的表達水平較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與空載體組比較，cP<0.05圖1 各組大鼠肝臟組織中羥脯氨酸的表達水平比較

2.2 各組大鼠肝臟組織的病理變化

H-E染色和Masson染色的結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織細胞變性和壞死程度均明顯加重，并伴有廣泛的炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積；與模型組和空載體組比較，過表達Prx5組的細胞變性和壞死程度均明顯減輕，這提示肝纖維化程度減輕。見圖2、3。

圖2 各組大鼠肝臟組織的病理圖像 H-E染色 ×100 A 對照組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達Prx5組

圖3 各組大鼠肝臟組織的膠原纖維沉積情況 Masson染色 ×100 A 對照組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達Prx5組

2.3 各組大鼠肝臟組織中Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA表達水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中Prx5 mRNA的相對表達量較低，而TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA的相對表達量較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達Prx5組大鼠肝臟組織中Prx5 mRNA的相對表達量較高，而TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA的相對表達量較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝臟組織中Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA表達水平比較

2.4 各組大鼠肝臟組織中Prx5、TGF-β1和STAT3蛋白水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中Prx5蛋白水平較低，而TGF-β1和STAT3蛋白水平較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達Prx5組大鼠肝臟組織中Prx5蛋白水平較高，TGF-β1和STAT3蛋白水平較低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖4、表3。

注：A指對照組，B指模型組，C指空載體組，D指過表達Prx5組圖4 各組大鼠肝臟組織中Prx5、TGF-β1和STAT3的蛋白電泳圖

表3 各組大鼠肝臟組織中Prx5、TGF-β1和STAT3蛋白水平比較

3 討論

本研究采用腹腔注射CCl4的方法構建了肝纖維化大鼠模型，通過檢測大鼠肝臟組織羥脯氨酸的表達水平，以及觀察肝臟組織的病理變化，從而判斷造膜是否成功。結果發現，在給予CCl4后，大鼠肝臟組織中羥脯氨酸的表達水平升高，肝細胞發生變性和壞死，有大量炎性細胞浸潤，肝臟組織膠原纖維沉積嚴重。上述結果提示肝纖維化大鼠模型造模成功，可用于后續研究。

Prx屬于過氧化物酶，具有清除哺乳動物細胞中活性氧及過氧亞硝酸鹽的能力[12]。Prx5作為Prx家族中的一員，可通過催化保守的過氧化物N端半胱氨酸中的分子內二硫鍵及還原C端半胱氨酸的殘基，降低過氧化氫、過氧亞硝酸鹽及烷基氫過氧化物等的表達水平[13]。Prx5主要通過炎性反應刺激而發揮作用，有研究表明Prx5在脂多糖誘導的巨噬細胞及小膠質細胞中高表達，并發揮抗氧化作用，抑制氧化應激損傷[14-15]。目前，關于Prx5在抗氧化應激及炎性反應調節方面作用的報道逐漸增多，但關于其與肝纖維化關系的報道仍較少。羥脯氨酸是膠原纖維的重要組成成分之一，其在肝臟組織中表達水平升高提示膠原纖維增多，纖維化程度加重。本研究結果表明，過表達Prx5組大鼠肝臟組織中羥脯氨酸表達水平降低，且病理圖像顯示其肝細胞組織形態、炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積情況均得到有效緩解，該結果提示過表達Prx5對肝纖維化大鼠的肝臟組織具有一定的保護作用，可抑制肝纖維化進展。

研究表明，TGF-β1可通過調控細胞外基質的代謝參與多種臟器纖維化的發生及發展過程[16]。在肝纖維化中，TGF-β1可促進成纖維細胞聚集、增殖和分化，同時上調細胞外基質的表達水平，致使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，從而促進肝纖維化進展[17]。此外，STAT3的活化在TGF-β1調控細胞外基質代謝的過程中起著重要作用[18-20]。本文探究了過表達Prx5對TGF-β1/STAT3信號轉導通路的影響，結果表明過表達Prx5可降低肝纖維化大鼠肝臟組織中TGF-β1和STAT3的mRNA及蛋白水平，這提示過表達Prx5可能通過調控TGF-β1/STAT3信號轉導通路而發揮其抗肝纖維化作用。

綜上所述，過表達Prx5對由CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠有一定的保護作用，可降低大鼠肝臟組織中羥脯氨酸的表達水平，緩解肝臟中炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積狀況，其作用機制可能與調控TGF-β1/STAT3信號轉導通路有關。