大黃素增強紫杉醇對小細胞肺癌裸鼠模型TTF-1、CD56、ProGRP的影響

王潘紅 鄭明 蔡云峰

小細胞肺癌（SCLC）是肺癌的一種特殊類型，約占所有肺癌的15%，相比于其他類型，SCLC 易出現侵襲性發展和遠處轉移，危害性較大［1］。SCLC 主要發生在吸煙人群中，由于吸煙人口逐年增多以及吸煙人口低齡化等情況，SCLC 的發病率每年都有所增長［2］。植物中提取的大黃素（EM）具有較高的藥用性［3］，有研究發現，大黃素對小鼠肝癌、淋巴肉癌、黑色素瘤和肺癌等均有較高抑制作用，可作為一種新型的抗癌藥物。紫杉醇（TAXOL）是一種從植物紅豆杉的樹皮中所提取的天然有效成分，具有較好的抗腫瘤活性，在臨床上已經用于多種癌癥的治療［4］，但在SCLC 治療中的應用較少，有學者指出，紫杉醇與其他抗腫瘤藥物聯合使用會有更好的治療效果［5-6］。本實驗擬通過建立SCLC裸鼠模型，探討紫杉醇聯合大黃素對模型裸鼠TTF-1、CD56、ProGRP 的影響，旨在為肺癌的臨床治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 BALB/ c-nu 裸鼠購自北京動物模型庫。裸鼠4～6 個月齡，體質量20～24 g，在（21±2）℃、40%～70%的濕度和12 h 的光/暗循環環境下飼養，本實驗嚴格遵守一般動物實驗倫理學原則。

1.2 儀器與試劑 大黃素（批號：wkq16071004，純度>98%）購自四川維克奇生物公司；紫杉醇（批號：130416-12，純度>98%）購自西昌市凱源康藥業公司；HE 染色液購自美國Origene；TTF-1、CD56、Pro-GRP抗體購自美國Sigma 公司；免疫組化試劑盒購自Abcam（中國）公司；NF05DH-1831 型血氣分析儀購自廣州華西科創科技有限公司；iTube 3000 全自動發光免疫分析儀購自煙臺艾德康生物科技有限公司。

1.3 實驗分組 通過脛骨結節骨髓腔注射方法構建SCLC 裸鼠模型［7］。將成功建模的裸鼠分為3組，分別為模型組、TAXOL組和TAXOL+EM組，每組各20 只，另選20 只健康裸鼠為空白組。其中TAXOL組裸鼠給藥60 mg/mL 紫杉醇，TAXOL+EM組裸鼠給藥30 mg/mL紫杉醇+30 mg/mL 大黃素，空白組和實驗組用同種方法給予等量的溶劑，共給藥14 d。

1.4 動脈氧分壓（PaO2）檢測 分別于給藥第1、7、14 天采集大鼠動脈血0.2 mL，采用血氣分析儀按照產品說明書進行檢測PaO2。

1.5 肺、肝組織HE 染色觀察 各組小鼠折頸處死，取其肺部組織。肺組織用體積分數10%甲醛固定、脫水、包埋、切片，然后對切片脫蠟和HE 染色，在光鏡下（×400）觀察組織病理形態。取裸鼠肝組織，操作同上述步驟，觀察SCLC 肝轉移的情況。

1.6 免疫組化檢測TTF-1、CD56 水平 肺組織經切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復。后加入一抗（1 ∶200），4℃過夜，PBS 洗3 次。加入生物素標記二抗，37℃孵育1 h。DAB 顯色液染色。蘇木素染核，酒精脫水，二甲苯透明30 min，中性樹膠封片，于倒置顯微鏡100 倍視野下觀察是否陽性。

1.7 CLIA 法檢測ProGRP 水平 取各組裸鼠外周血，按照全自動發光免疫分析儀機器說明書操作，檢測裸鼠血清中ProGRP 的水平。

1.8 RT-PCR 法檢測TTF-1、CD56、ProGRP 的mRNA水平 取出大鼠肺組織，用Trizol 法裂解并提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒將mRNA 反轉錄成cDNA。在冰上準備50 μL PCR 擴增反應體系：2XSYBR25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水20.7 μL，TaqDNAPolymerase0.3 μL。在實時熒光定量PCR 儀上反應，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，45 個循環，95℃10 s，65℃60 s，97 ℃1 s。記錄各孔Ct 值，以β-actin 作內參，采用2-ΔΔCt計算各mRNA 的相對表達量，計算公式為：ΔΔCT=ΔCt 實驗-ΔCt 空白，其中ΔCt=Ct 目的-Ct內參。引物序列及產物大小見表1。

表1 引物序列表（5'→3'）

1.9 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD 檢驗，計量資料用卡方檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間PaO2比較 模型組，TAXOL組和TAXOL+EM組在1 d、7 d及14 d PaO2水平均低于空白組（P<0.05）；TAXOL組和TAXOL+EM組PaO2水平隨著持續給藥而升高，且均高于模型組（P<0.05）；TAXOL+EM組各時間點PaO2水平均高于TAXOL組（P<0.05），見表2。

表2 不同時間段各組PaO2比較［mmHg，（）］

表2 不同時間段各組PaO2比較［mmHg，（）］

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與TAXOL組比較，△P<0.05

2.2 肺組織染色結果比較 與空白組比較，其他組裸鼠肺組織明顯發生病變，肺泡間隙變小；與模型組比較，TAXOL組和TAXOL+EM組肺部組織病變情況有所緩解；與TAXOL組比較，TAXOL+EM組肺組織恢復情況更好，見圖1。

圖1 各組肺組織HE染色情況

2.3 各組肝轉移結果比較 與空白組比較，其他組裸鼠肝組織出現結節，病理染色結果與肺組織結果相似，提示肺癌細胞發生肝轉移；與模型組比較，TAXOL組和TAXOL+EM組肝組織轉移程度有所減輕；與TAXOL組比較，TAXOL+EM組肝組織情況更好。見圖2。

圖2 各組肝組織HE染色情況

2.4 各組TTF-1、CD56、ProGRP 水平比較 見表3。

表3 各組TTF-1、CD56、ProGRP水平比較

2.5 各組TTF-1、CD56、ProGRP 的mRNA 水平比較 見表4。

表4 各組TTF-1、CD56、ProGRP的mRNA水平比較（）

表4 各組TTF-1、CD56、ProGRP的mRNA水平比較（）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與TAXOL組比較，△P<0.05

3 討論

SCLC 是神經內分泌型肺癌的一種，相比于其他類型的肺癌具有更高的侵襲能力。SCLC 由于其高增殖、轉移快等特點，易復發和和惡化，是一類危害較大的惡性腫瘤［8］。SCLC 單純通過手術切除治療療效欠佳，臨床上通常聯合使用化療或放療方法［9］。

紫杉醇是多種癌癥化療的常用藥物，受到廣泛的關注和研究。紫杉醇通過結合微管蛋白抑制其聚解，導致其排列異常并阻斷腫瘤細胞正常的有絲分裂紡錘體發育和隨后的細胞分裂達到抗腫瘤效果［10］。同時由于腫瘤細胞的抗藥性等原因，單一使用紫杉醇治療的手段急需改進。紫杉醇聯合其他藥物被認為可以有效增強其功效。劉曉潔等通過體外細胞培養實驗發現，白藜蘆醇聯用紫杉醇可以通過增加P-gp 蛋白的表達，有效促進食管癌EC109 細胞的凋亡［11］；TOMOYUKI 等［12］研究發現紫杉醇聯合雷公藤治療晚期胃癌患者具有更高的的療效和安全性。盧娜等研究指出，姜黃素聯合多西紫杉醇對人肺癌細胞放療增敏機制與腫瘤細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡有關，且在紫杉醇濃度為60 mg/mL時效果最好［13］。大黃素是天然的生物抑制劑，近年來作為抗癌藥物被廣泛研究。何敏等通過實驗發現蘆薈、大黃素聯用順鉑可以增強乳腺癌細胞的凋亡［8］。

TTF-1 是NKX2 家族的一種轉錄基因核蛋白，常在肺組織和甲狀腺組織及其癌變過程出現、表達，影響多種基因調控，>90%原發性SCLC 表達陽性TTF-1［14］。CD56 是一種跨膜神經細胞糖蛋白黏附分子，是肺神經內分泌腫瘤首選的特異性標志物［15］。PROGRP 是腦腸激素的一種，是SCLC 增殖因子胃泌素釋放肽的前體，可作為SCLC 特異性腫瘤標志物［16］。

本研究結果顯示，紫杉醇與大黃素聯用可以有效降低裸鼠TTF-1、CD56、ProGRP 水平，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，且效果比單一使用紫杉醇更好，這與上述研究結果相似。同時，隨著給藥時間的延長，單一使用紫杉醇的小鼠PaO2上升水平減緩，而紫杉醇和大黃素聯用給藥的小鼠PaO2持續上升，提示紫杉醇與大黃素聯用的抗腫瘤效果不僅優于同濃度的紫杉醇，且可能在一定程度上能克服腫瘤細胞的抗藥性，從而達到持續抑制的效果。

綜上所述，大黃素可以增強紫杉醇對SCLC 裸鼠TTF-1、CD56 及ProGRP 的影響，降低TTF-1、CD56及ProGRP 表達水平，有效抑制SCLC，同時可以在一定程度上減少腫瘤細胞的抗藥性，達到持續抑制的效果，為SCLC 的治療提供新的科學思路。