腦卒中后抑郁大鼠海馬和丘腦神經生長因子及其高親和力受體TrkA mRNA和蛋白的表達變化

劉新黎 馮炯 胡浩宇 陳家俊

腦卒中后抑郁（PSD）是腦卒中引起的一種有情感障礙性疾?。?］，是一種心理障礙，臨床癥狀顯著，主要為興趣減退、情緒低落，對患者預后造成嚴重不良影響［2-6］。同時，在腦卒中復發、神經功能康復的影響因素中，PSD 也是一個獨立危險因素。本研究探討PSD大鼠海馬和丘腦神經生長因子（NGF）及其高親和力受體TrkA mRNA 和蛋白的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 金華市職業技術學院動物實驗中心提供的52 只清潔級健康成年雌性SD 大鼠，體質量200～250 g，符合實驗處置動物和實驗動物倫理學標準。購自上海信裕生物科技有限公司生產的TrkA 兔抗單克隆抗體（xy11073-MM04）、免疫組織化學實驗試劑NGF，上?？祈樕锟萍加邢薰旧a的TR-IZOL 試劑盒、RTPCR 試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）引物、神經生長因子（NGF）及其高親和力受體TrkA。

1.2 動物模型的分組及處理方法 對大鼠進行行為學評分，應用Open-field 法，選擇評分相近的大鼠進行隨機分組，共4組，分別為PSD組、腦卒中組、抑郁組及對照組，每組各13 只。PSD組：應用線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，每籠飼養1 只，術后1 周應用孤養法與慢性不可預見的溫和應激刺激（CUMS）中7 種刺激方式：①禁食（24 h）、②禁水（24 h）、③夾尾（2 min）、④冷水游泳（4℃，5 min）、⑤潮濕墊料、⑥傾斜鼠籠、⑦束縛（1.5 h）。建立PSD 大鼠模型；腦卒中組：應用線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，每籠飼養6～7 只；抑郁組：每籠喂養1 只，運用孤養法與慢性不可預見的溫和應激刺激（CUMS）建立大鼠抑郁模型；對照組：每籠喂養6～7 只，正常飲食及飲水，與模型組同時進行蔗糖水消耗實驗。

1.3 方法（1）組織制備：取材時間設計在造模后4周，向大鼠腹腔注入1 mL/100 mg 3.6%水合氯醛進行麻醉，將8 只大鼠取出，依據大鼠解剖立體定向譜圖將100 mg 丘腦底核組織、0.5 cm 海馬CA1、CA3 區從冠狀面上切取下來。用焦碳酸二乙酯（4℃預冷）處理標本，用水沖洗3 次，將血跡清洗掉，在EP 管中放置，保存在-80℃的冰箱中，或第一時間在RT-PCR檢測中應用。將5 只大鼠取出，在免疫組織化學實驗中應用，用4%多聚甲醛（有飽和苦味酸）+生理鹽水灌洗，起點為左心室，將丘腦底核組織、海馬CA1、CA3 區從冠狀面上切取下來，在20%蔗糖溶液中放置，浸泡2 d，在4℃冰箱中沉底，用石蠟包埋方法，進行冠狀切片，厚度為10 μm。（2）RT-PCR 檢測海馬和丘腦NGF mRNA 及TrkA mRNA 表達：將內參GADPH、TrkA、NGF mRNA序列從GenBank 里查找出來，引物序列設計過程中采用Primer premier 5.0 軟件。用TRIZOL 試劑盒分別提取丘腦和海馬的總RNA，采用紫外分光光度儀對其純度、濃度進行測定。將cDNA 合成，在此過程中嚴格依據試劑盒說明書。在PCR 擴增反應中直接應用合成的cDNA第一條鏈，操作過程中嚴格依據2×PCR Master Mix Kit試劑盒說明書。NGF、TrkA 及GADPH 引物序列與退火溫度見表1。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測，并在BIO-GEL 凝膠成像儀紫外模式下對凝膠圖片進行拍攝，再采用BIO-GEL 凝膠分析系統對各目的基因條帶及吸光度值進行測定。校正數據后將目的基因/GADPH 計算出來，設定為相對表達量。（3）免疫組織化學染色：采用免疫組織化學二部法對各組石蠟切片進行染色，一抗為TrkA、NGF 兔抗單克隆抗體（Swiss EPIT MICS），最佳反應濃度為1 ∶150。將一抗加入腦的切片中，放置在4℃冰箱中過夜，然后將PV-9000 試劑盒中的試劑1 加入，在37℃溫箱中進行30 min 的孵育，漂洗后再將PV-9000 試劑盒中的試劑2（羊抗兔）加入，脫水、透明、封固過程中分別將梯度酒精、二甲苯、中性樹膠充分利用。陰性對照為磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將一抗取代。每組共5 只大鼠，從每只大鼠選取5 張不連續切片，每張切片用BA300 數碼照相機在Motic 顯微鏡下進行拍攝，對5 個視野（400×）進行拍照，對丘腦和海馬免疫陽性細胞數進行雙盲計數。

表1 NGF、TrkA及GADPH引物序列與退火溫度

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件，計量資料用（）表示，多組比較用單因素方法分析，組間兩兩比較用LSD-t 法，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠丘腦和海馬NGF、TrkA mRNA 表達比較 PSD組大鼠海馬NGF、TrkA mRNA 表達低于對照組（P<0.05），見表2。

表2 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA mRNA表達比較（）

表2 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 4組大鼠丘腦和海馬NGF、TrkA 免疫陽性細胞數比較 PSD組大鼠海馬NGF 陽性細胞數少于對照組（P<0.05）見表3。

表3 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA免疫陽性細胞數比較如下［個/視野，（）］

表3 4組大鼠的丘腦和海馬NGF、TrkA免疫陽性細胞數比較如下［個/視野，（）］

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討論

腦卒中通常以急性起病，較快出現神經功能缺損，是一種常見的腦血管疾病。腦卒中患者最常出現的臨床表現是偏癱、偏身麻木、偏盲、失語、構音障礙、口角歪斜，甚至昏迷、抽搐等不同程度的神經功能障礙。臨床上引起腦卒中的病因根據TOAST分型有5型，其中大動脈粥樣硬化型最為常見，其余還包括心源性栓塞型、小動脈閉塞型、其他明確病因型（如血管炎、血管畸形等）、不明原因型。其中最常見的危險因素是高血壓；甚至有一部分患者卒中前即患有不同程度的抑郁癥，故有研究認為抑郁癥是引起腦卒中［7-9］的危險因素。卒中后幸存者中>30%［10］的患者患抑郁癥。PSD 不僅會產生情緒低落、主動性差、興趣喪失和睡眠障礙等降低生活質量的臨床表現［11］，且對卒中預后神經功能缺損和認知功能恢復存在負面影響，導致患者生活質量和滿意度下降，增加社會功能缺陷和病死率［12］。PSD 既是卒中后的常見并發癥，又是影響卒中預后的危險因素，二者互為因果，若未能及時診療，可造成惡性循環，給家庭和社會造成沉重負擔［13］。

相關醫學研究表明［14］，在PSD 大鼠發病過程中，NGF mRNA 表達降低可能發揮重要作用。本實驗結果顯示，PSD組大鼠海馬NGF mRNA 表達低于對照組，PSD組大鼠海馬NGF 陽性細胞數少于對照組，表明PSD大鼠海馬和丘腦神經生長因子及其高親和力受體TrkA mRNA 和蛋白表達降低?？赡茉蚴侨ゼ啄I上腺素能神經元和5-羥色胺能神經元及其徑路在腦卒中后被破壞，造成神經遞質低下，進而出現抑郁。PSD 發病機制復雜，涉及神經生物學、神經解剖學、社會心理學、神經內分泌學等諸多因素［15］。神經生物學認為PSD 是一種器質性抑郁，其解剖通路為腦干中存在5-HT 及NE神經元細胞體，神經纖維通過丘腦與基底神經節投射到額葉大腦皮質和海馬區域，調控人類情緒和情感［16］。