玉米果種皮對其種子萌發及生理特性的影響

劉 京， 朱凱麗， 岳海旺， 李賀勤， 張海艷， 趙延明， 楊然兵， 尚書旗， 江緒文

(1.青島農業大學玉米研究所， 山東 青島 266109；2.河北省農林科學院旱作農業研究所， 河北 衡水 053000)

種子是最基本的農業生產資料，其萌發質量直接關系農業生產的成敗。種子萌發作為一個復雜的生理過程，根據定義它始于具有生活力的干種子吸脹作用，結束于胚根突破所有覆蓋層而伸出[1]。種皮作為重要種胚覆蓋層之一，是由數層起源于受精引起的胚珠被分化而形成的特殊細胞所組成[2]。目前關于種皮在調控種子發育、萌發等方面已取得一些進展。Beeckman等[3]基于組織學研究發現，擬南芥種皮可能是在種胚發育階段與種胚協調作用下形成。Buzi等[4]發現，種子發育后期許多與脅迫相關的蛋白會儲存在種皮中，使種子貯藏具有抗菌能力，并在調節種子壽命、發芽和幼苗建成中發揮重要作用。此外，種皮原花青素[5]、種皮黏液[6]等在對擬南芥、烏桕等種子萌發調節中均具有重要作用。因種皮特性而導致的不透水和(或)不透氧、機械限制等是導致許多植物種子休眠、萌發受阻的重要原因[7]。Khodakovskaya等[8]對番茄種子種皮穿刺處理后發現，種皮穿刺可加速種子內部吸水，種子萌發12 d和20 d的發芽率比對照分別提高42%和11%。Duval等[9]發現，去除種皮可有效打破三倍體西瓜種子萌發障礙與種皮機械限制進而促進種子萌發，其中種子發芽率可提高70%。

玉米(ZeamaysL.)作為世界上最重要的糧飼、能源作物之一，在全球經濟發展中具有重要的地位和不可替代的作用。種子質量差一直是中國玉米生產發展和產量提高的一個重要限制因素[10-11]。Li等[11]對2013—2018年中國市售玉米品種種子質量進行了調研，發現種子質量整體雖呈上升趨勢，但市售玉米品種在種子活力等方面仍存在遺傳缺陷，有待深入解析。馬潔等[12]發現劃傷果種皮后玉米種子吸水速率加快，與對照相比，中農大4號活力指數提高0.229，苗長增加0.7 cm。與其他植物相比，關于玉米果種皮對種子萌發及生理特性的影響研究甚少，包括其對果種皮破裂、胚根鞘破裂等種子萌發關鍵事件發生及重要種胚組織代謝調控機理等尚不清楚，非常值得深入探討。

本試驗以不同玉米品種種子為材料，圍繞上述問題開展初步研究，以期為玉米種子萌發機理深入研究及高活力品種選育等提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

玉米品種為鄭單958、先玉335、蠡玉16和迪卡007；參照農作物種子檢驗規程GB/T 3543.6-3543.7(國家技術監督局1995)[13]測得這4個品種種子千粒重分別為357.7、284.9、342.3 g和306.8 g，水分含量分別為11.7%、11.4%、11.5%和11.4%。各品種種子均為2019年收獲，低溫冷庫中干燥貯藏。

1.2 試驗方法

1.2.1果種皮特性測定

果種皮吸水特性觀測：參考《種子檢驗學》[14]的方法，略有改動。取大小均一、健康飽滿的凈種子50粒，3次重復，共150粒，將種子溫水(30～35 ℃)浸種4～8 h后，將其果種皮剝離收集并低溫烘干至恒重，備用。50粒種子的果種皮為1個重復，3次重復，于25 ℃恒溫箱內進行果種皮吸水特性測定，每隔10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，3.5 h，4 h取出試樣，輕拭表面浮水，稱重，計算果種皮吸水速率和最大吸水量。

果種皮厚度測定：取大小均一、健康飽滿的凈種子50粒，3次重復，共150粒，種子吸脹24 h后，沿中部縱切制片，用Leica DM 6 B顯微鏡結合配套圖像分析軟件對種子胚部、背部、底部的果種皮厚度進行多點(>6)觀測，果種皮厚度以數據集最中部的3個數值的平均值表示。

覆胚果種皮(the testa-pericarp covering embryo, TCE)穿刺力測定：取大小均一、健康飽滿的凈種子50粒，3次重復，共150粒，利用自研的種子生物力學評價系統(A System for Automated Seed Biomechanical Assessment, ASASBA)進行TCE穿刺力測定，TCE穿刺力以數據集最中部的3個數值的平均值表示。穿刺力測定主要參數為：探針直徑0.5 mm，移動速度30 mm·min-1，環境濕度99%，環境溫度25 ℃。

1.2.2標準發芽和幼苗生長測定

參照農作物種子檢驗規程GB/T 3543.4(國家技術監督局1995)[13]進行卷紙發芽測定。取大小均一、健康飽滿的凈種子100粒，3次重復，共300粒，用1%次氯酸鈉溶液消毒10 min(包衣種子清水稍加清洗后消毒)，消毒后用蒸餾水沖洗3遍，拭去種子表面浮水后，備用。以移除TCE的種子為處理(用醫用手術刀在體視鏡下移除TCE)，未處理的種子為對照。取2張發芽紙(380 mm×255 mm，美國Anchor)疊放好，用油性記號筆標識樣品信息，蒸餾水充分潤濕后用無菌紗布輕拭床面，除去余液和紙間氣泡，種子交錯置床，種孔朝向一致，紙邊距5 cm。置床后卷起放入自封袋，垂直置于人工氣候箱中(25±0.5)℃發芽(種孔端朝下，12 h光暗交替)。

逐日統計種子發芽數目，發芽4 d計算發芽勢，發芽7 d計算發芽率，同時計算發芽指數和平均發芽天數。統計發芽率的同時，隨機選取大小均一的10株種苗進行芽(苗)長、主根長、芽(苗)鮮重、根鮮重、芽(苗)干重和根干重等6項指標測定，其中烘干條件為105 ℃烘8 h。

1.2.3總淀粉含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量測定

采用雙波長法[15]、凱氏定氮法[16]和索氏提取法[17]分別測定樣品種子的總淀粉含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量；參照《種子學實驗技術》[18]的方法進行操作，3次重復。

1.2.4破裂測定

選取2個玉米種子萌發質變事件： 1) 果種皮破裂：胚根鞘伸長生長突破果種皮； 2) 胚根鞘破裂：胚根伸長生長突破胚根鞘或胚根鞘組織弱化破裂胚根伸出。基于標準發芽(同1.2.2)，種子置床后24、36、48、60、72、84、96 h和108 h統計果種皮破裂和胚根鞘破裂種子數，計算果種皮破裂率和胚根鞘破裂率。以移除TCE的種子為處理，未處理的種子為對照。

果種皮破裂率(%)=(果種皮破裂種子數/待測種子總數)×100%；

胚根鞘破裂率(%)=(胚根鞘破裂種子數/待測種子總數)×100%；

1.2.5酶活性測定

取足夠量的種子進行標準發芽(同1.2.2)，以移除TCE的種子為處理，未處理的種子為對照。萌發60 h時收集種胚(已發生胚根鞘破裂)的胚中部(胚芽與胚根銜接部)、胚根和胚根鞘3部分組織，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性[19]；采用愈創木酚法測定過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性[18]；采用NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性[20]。不同組織分別取約0.1 g樣品，6次重復，-80 ℃保存備用；酶活性以數據集最中部的3個數值的平均值表示。

1.2.6數據分析

采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 20.0軟件對數據進行處理、相關性分析和差異顯著性檢驗(LSD法)。

2 試驗結果

2.1 不同玉米品種果種皮吸水特性比較

由圖1可見，4個玉米品種果種皮吸水量均呈快速吸水至平穩的變化趨勢，但不同品種果種皮最大值吸水量不同。其中鄭單958果種皮具有最大吸水量，為1.02 g·(50粒)-1。

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

2.2 不同玉米品種果種皮厚度及覆胚果種皮生物力學特性比較

由圖2可見，4個玉米品種間以及同品種不同部位間果種皮厚度不同。從TCE厚度來看，鄭單958最厚，為53.33 μm，且與其他3個品種差異顯著；4個玉米品種TCE穿刺力大小不同，鄭單958最大，為1.81 N，且與其他3個品種差異顯著。

注：同顏色不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 玉米TCE對種子發芽及幼苗生長的影響

由表1可見，移除TCE能促進玉米種子發芽和幼苗生長，但對不同品種影響程度不同。從各項發芽指標來看，處理后鄭單958、先玉335和蠡玉16的發芽勢和發芽率與對照相比均有所提高；處理后各品種平均發芽天數均顯著縮短，發芽指數也明顯高于對照且差異顯著，其中先玉335提高了58.10%。從各項幼苗生長指標來看，處理后各品種芽(苗)長、主根長、芽(苗)鮮重、根鮮重、根干重均明顯高于對照且差異顯著。

表1 TCE對4個玉米品種種子發芽的影響

2.4 玉米TCE指標與其他性狀指標的相關分析

由表2可見，TCE穿刺力與TCE厚度極顯著正相關。TCE穿刺力和TCE厚度2項指標與平均發芽天數均呈正相關，與芽(苗)長、主根長、芽(苗)鮮重、芽(苗)干重、根鮮重、根干重和種子粗脂肪含量均呈負相關，與種子總淀粉含量呈正相關，與種子粗蛋白含量分別呈正相關和負相關。

表2 4個玉米品種TCE指標與其他性狀指標的相關分析

2.5 玉米TCE對種子萌發事件發生速率的影響

果種皮破裂和胚根鞘破裂是兩個重要的玉米種子萌發事件[21]。由圖3可見，4個玉米品種果種皮破裂率均呈先增加后降低的變化趨勢，而胚根鞘破裂率和(果種皮破裂+胚根鞘破裂)率2項指標均呈快速增加至平穩的變化趨勢。與對照相比，移除TCE后4個玉米品種胚根鞘破裂率指標變化速率均明顯上升，如：種子萌發60 h時，移除TCE后4個玉米品種胚根鞘破裂率均明顯高于對照，其中鄭單958提高了22.59%(圖3 B和圖3 D)。

注：A為對照果種皮破裂率變化趨勢圖；B為對照胚根鞘破裂率變化趨勢圖；C為對照(果種皮破裂+胚根鞘破裂)率變化趨勢圖；D為處理胚根鞘破裂率變化趨勢圖。

2.6 玉米TCE對種子萌發不同胚組織酶活性的影響

由圖4可見，種子萌發60 h，4個玉米品種胚中部、胚根和胚根鞘3部分組織中CAT、POD、SOD活性大小不同。從整體數據來看，CAT活性大小為胚根>胚根鞘>胚中部；POD活性大小為胚中部>胚根鞘、胚根>胚根鞘，但在胚中部和胚根之間的規律不明顯；SOD活性大小為胚中部>胚根鞘>胚根。移除TCE處理后，除鄭單958胚中部組織SOD活性與對照相比略有下降但差異不顯著外，其余品種處理后各組織3種酶活性均高于對照。

注：A、B和C分別為胚中部、胚根、胚根鞘組織CAT活性測定結果；D、E和F分別為胚中部、胚根、胚根鞘組織POD活性測定結果；G、H和I分別為胚中部、胚根、胚根鞘組織SOD活性測定結果。

3 討 論

種皮作為種子重要覆蓋層，在種子發育、萌發等過程中發揮重要作用，包括為種胚發育提供營養，保護種胚免受不利環境影響等[22]。玉米種子萌發伴隨著果種皮破裂、胚根鞘破裂等重要萌發事件的發生，主要表現為胚根鞘伸長生長克服覆胚果種皮(the testa-pericarp covering embryo, TCE)機械限制以協助胚根伸出等方面[21]。特別是種子萌發中胚根伸出快慢可有效評價種子活力高低[23]，但目前關于果種皮特別是TCE對玉米種子萌發及生理特性的影響研究甚少，故本研究以鄭單958、先玉335、迪卡007和蠡玉16等4個玉米品種為材料，開展了以下相關工作。

3.1 不同玉米品種果種皮吸水特性及厚度比較

種子萌發吸脹速率與種被和內含物致密度等有關[24]。不同植物種子吸水特性不同，王俊絹等[25]認為，棉花種子的吸水率與種子活力存在顯著負相關；山金鳳等[26]發現，皇后帝王花種皮結構對種胚吸水無阻礙，但可能對種胚呼吸、胚根伸長存在影響等。在玉米方面，李文端等[27]指出不同類群玉米自交系間種子吸水速率無顯著差異，但在吸水時間上存在顯著差異；馬潔等[12]認為，不同玉米品種吸水速率和活力水平不同，且與種子活力無明顯相關性。本研究發現，4個玉米品種果種皮吸水量隨萌發時間推移均呈快速增加至平穩的變化趨勢，其中鄭單958果種皮吸水量最大，果種皮吸水特性差異可能會影響玉米種子萌發速率。此外，在種皮厚度方面，目前主要涉及其與種子硬實等相關的研究報道[26]。本研究發現，4個玉米品種不同種子部位的果種皮厚度不同，其中鄭單958的TCE厚度最厚。

3.2 玉米TCE生物力特性對種子萌發的影響

從生物力學角度來看，種子由種胚和外圍組織層組成。種子萌發時，種胚感受外部環境信號激發自身組織伸長生長，而外圍組織層可能在種胚萌發活力水平恢復提升至閾值中扮演重要角色，只有當種胚活力水平超過一定閾值時胚根才能順利伸出完成萌發[21,28]，故一些報道基于力學測量對胚乳等組織強度進行分析，以研究種子萌發休眠機理。Müller等[29]利用自研裝備結合直徑0.3 mm的金屬探針，推進速度2 mm·min-1成功檢測獨行菜種子萌發中胚乳的穿刺力大小。Holloway等[30]基于胚根鞘組織穿刺力測定闡述了小麥種子休眠和萌發新機制。本研究對4個玉米品種種子TCE進行穿刺力測定以評價其機械強度，發現鄭單958最大，這可能與其厚度及果種皮內所含物質有關；相關性分析表明，TCE穿刺力與TCE厚度極顯著正相關。與對照相比，移除TCE處理后，4個玉米品種種子的發芽勢、發芽率、發芽指數均有所提高，且平均發芽天數明顯縮短，種子萌發胚根鞘破裂率指標變化速率明顯上升，且TCE越薄則其對種子萌發機械阻力越小，發芽速率更快。上述相關結論與馬潔等發現劃傷玉米果種皮處理可加快種子吸水速率[12]，進而顯著提高種子的活力指數、幼苗長度等指標測定值的結論一致。此外，邢妍妍等[31]對不同生育期新鮮玉米種子和移除果種皮后種子的發芽情況進行比較分析，發現種子發育初期移除果種皮可提高種子發芽率，但種子萌發后生長緩慢，而本研究采用發育成熟的玉米種子，移除TCE不僅可提高種子發芽率而且一定程度上促進了種苗形態建成。

3.3 玉米TCE對種子萌發不同種胚組織酶活性的影響

種子萌發伴隨著各種生理、生化和分子生物學變化以及相關形態特征的變化。胚根鞘作為禾本科植物種子特有器官，在玉米種子萌發中伸長生長與TCE發生生物力作用，以協助胚根伸出完成萌發[21]。研究TCE對玉米種子萌發不同種胚組織(包括胚中部、胚根、胚根鞘等)酶活性的影響對深入解析種子萌發機理非常重要。目前已有不少關于種子萌發酶活性變化的研究報道，Scheler等[32]研究發現，獨行菜種子細胞壁果膠甲基化與果膠甲基酯酶(PME)基因的特異表達和胚乳、胚根、下胚軸中相關酶活性有關，PME處理可提高種皮透性，促進種皮破裂。本研究比較了4個玉米品種移除TCE處理的種子和未處理的種子在萌發60 h時，胚中部、胚根、胚根鞘組織CAT、POD、SOD活性變化情況，結果表明處理后各品種胚中部、胚根和胚根鞘組織CAT、POD、SOD活性基本呈上升趨勢；此外，不同種胚組織內酶活性大小也存在一些規律，如：CAT活性大小為胚根>胚根鞘>胚中部，SOD活性大小為胚中部>胚根鞘>胚根。

本研究初步探討了果種皮特別是TCE對4個玉米品種種子萌發及生理特性的影響，并得到了一些重要結論，但在TCE與胚根鞘生物力作用機理、不同種胚組織間SOD等關鍵酶的活性大小差異產生機理、TCE對種胚組織內源激素含量的影響以及對相關重要基因功能調控機制等方面還有待深入研究。