農桿菌介導幾種不同馬鈴薯外植體轉化研究

曹貞菊， 李 飛， 陳明俊， 羅小波， 李 標， 尹 旺

(貴州省農業科學院生物技術研究所，貴州省馬鈴薯工程中心， 貴陽 550006)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)起源于南美洲，茄科茄屬草本植物，是繼水稻、小麥和玉米后的第四大糧食作物。中國馬鈴薯種植面積占世界總種植面積的30%，種植分布區涵蓋寒帶、溫帶、亞熱帶、熱帶等多種生態區，發展馬鈴薯產業對保障中國糧食安全、西部扶貧開發、種植結構調整和農民增收具有重要意義[1]。然而馬鈴薯易受非生物脅迫的影響，包含高溫、冷凍、鹽分、干旱、水澇、輻射及重金屬毒性等，這在很大程度上阻礙了馬鈴薯生長且造成嚴重經濟損失[2]。其中，冷凍脅迫是影響馬鈴薯產量的主要因素之一。當溫度低于-3 ℃時，馬鈴薯很難存活[3]。2008年，中國南部的冰雹導致馬鈴薯直接經濟損失高達15億元[4]。而近年來氣候變化加劇，極端天氣愈加頻繁，挖掘植物自身的耐凍基因，培育耐低溫霜凍的馬鈴薯品種尤顯必要[5]。

脂肪酸脫氫酶基因(FAD2)是植物體內脂肪酸代謝中油酸轉變為亞油酸的關鍵基因。植物的耐霜凍性依賴于體內飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，飽和脂肪酸在脂肪酸脫氫酶的作用下轉變單鍵為雙鍵合成不飽和脂肪酸，并且單個脂肪酸的不飽和程度通常受基因和環境的調控[6]。

用農桿菌介導幾種不同馬鈴薯外植體將具有耐凍性的FAD2基因轉入馬鈴薯中，并比較不同馬鈴薯外植體轉化效率，獲得較為便捷、穩定的轉化方法，為馬鈴薯基因轉化研究提供可行方案。期望獲得綜合抗逆性明顯增強的優良馬鈴薯新品系，為馬鈴薯抗性育種提供新材料，創造新種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與菌株

供試馬鈴薯品種中薯8號微型薯和中薯8號組培苗來自中國農業科學院蔬菜花卉研究所；黃金薯微型薯和Desiree組培苗由貴州省馬鈴薯工程中心實驗室保存；FAD2基因由貴州省馬鈴薯工程中心實驗室克隆；根癌農桿菌為GV 3101(購自上海維地生物技術有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1農桿菌活化

-80 ℃低溫保存的GV 3101農桿菌株含有FAD2基因，接種到含有Kan(50 μg·mL-1)和Rif(20 μg·mL-1)的YEB固體培養基上，28 ℃培養48 h，挑取單菌落接種于5 mL含有Kan(50 μg·mL-1)和Rif(20 μg·mL-1)的液體培養基中，28 ℃培養24 h，再吸取2 mL菌液接種到50 mL含有Kan(50 μg·mL-1)和Rif(20 μg·mL-1)的液體培養基中，培養3～4 h，觀察菌落生長情況并測OD600值，待OD600值到0.4時進行馬鈴薯外植體侵染。

1.2.2遺傳轉化

1) 農桿菌介導微型薯遺傳轉化

將中薯8號微型薯、黃金薯微型薯分別用蒸餾水沖洗干凈，并用1%的次氯酸鈉浸泡過夜，去皮切成1～2 mm的薄片，放入準備好的含FAD2基因的GV 3101菌液中浸泡10 min。用無菌鑷子夾出，再無菌濾紙吸干表面多余菌液，轉入含有4 mg·L-1ZT和0.2 mg·L-1IAA的MS共培養基上。28 ℃下黑暗培養2 d，見薯塊周圍出現淡淡一圈菌斑即可。

用無菌蒸餾水清洗共培養后的薯塊3次，再用含有250 mg·L-1TIM的無菌蒸餾水浸泡薯塊15 min，置于經高溫滅菌的濾紙上，待薯塊表面干后，轉至含有4 mg·L-1ZT+0.2 mg·L-1IAA+250 mg·L-1TIM的MS培養基上進行脫菌培養7 d，在培養皿上蓋上6層紗布，每天去除一層紗布，光照強度由弱到強，培養條件為24 ℃、1 500 lx、光照16 h/暗8 h的光周期下培養。將薯塊轉至含有4 mg·L-1ZT+0.2 mg·L-1IAA+250 mg·L-1TIM+50 mg·L-1Kan的MS培養基上進行抗性篩選培養，待分化出再生植株長到2～3 cm時，從愈傷組織上切下再生苗插入含有1 mg·L-1IBA+150 mg·L-1TIM的生根培養基中進行生根培養。

2) 農桿菌介導馬鈴薯組培苗莖段遺傳轉化

將用于轉化所需的中薯8號無菌苗和Desiree無菌苗(培養4～5周)，在超凈工作臺內，每個莖段切成1～1.5 cm長，需確保莖段上不含有生長點，在馬鈴薯預培養基上培養2 d，再在農桿菌GV 3101中浸泡莖段10 min，用吸水紙吸干后均勻排布在馬鈴薯共培養基上，黑暗條件下培養3 d，然后將莖段轉至馬鈴薯愈傷培養基上培養，待2～3周后愈傷組織完全長出，將材料轉接到馬鈴薯分化培養基上直至長出嫩芽，將1～2 cm嫩芽切下插入馬鈴薯生根培養基中，誘導完成完整的抗性組織。

馬鈴薯預培養基：MS固體培養基+2，4-D(0.1 mg·L-1)+6-BA(1 mg·L-1)

馬鈴薯共培養基：MS固體培養基+2，4-D(0.1 mg·L-1)+6-BA(1 mg·L-1)+AS(0.1 μmol·L-1)

馬鈴薯愈傷培養基：MS固體培養基+2，4-D(0.1 mg·L-1)+6-BA(1 mg·L-1) +TIM(100 mg·L-1)+Kan(50 mg·L-1)

馬鈴薯分化培養基：MS固體培養基+GA3(1 mg·L-1)+ZT(1 mg·L-1) +TIM(100 mg·L-1)+Kan(50 mg·L-1)

馬鈴薯生根培養基：1/2 MS固體培養基+IBA(1 mg·L-1)+TIM(150 mg·L-1)

1.2.3轉化株PCR檢測

參照BioMIG試劑盒操作說明提取馬鈴薯總DNA，以轉化株的總DNA為模板，未轉化株的總DNA為對照，正向引物為35 S-F 序列為5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，反向引物為FAD2-SmaⅠ-R序列為5′-TCAAGCGTAGTCTGGCATTACTTTTTTAAG-3′，擴增產物長度約為1 300 bp。通過PCR溫度梯度試驗，最佳退火溫度為50 ℃。PCR反應體系包括10 μL 2×M 5-Tag -Mix，1 μL的35 S-F正向引物，1 μL的FAD2-SmaⅠ-R反向引物，1 μL DNA模板，用ddH2O補20 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環；最后72 ℃延伸7 min，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行檢測。

2 結果分析

2.1 農桿菌介導微型薯遺傳轉化結果分析

經過農桿菌侵染后的中薯8號微型薯薯片、黃金薯微型薯薯片在MS共培養基上28 ℃條件下黑暗培養2 d，轉至含有4 mg·L-1ZT+0.2 mg·L-1IAA+250 mg·L-1TIM的MS培養基上進行脫菌培養7 d。將薯塊轉至含有Kan抗生素的MS培養基上進行抗性篩選培養，并逐漸分化出很多小突起。約35 d后，外植體開始萌生小芽點(圖1)。待分化出的再生植株長到 2～3 cm時，從愈傷組織上切下再生苗插入含有Kan的生根培養基中進行生根培養。經過Kan連續篩選，獲得中薯8號微型薯轉化抗性植株15株，黃金薯微型薯轉化抗性植株12株。

注：A為黃金薯轉化15 d；B為黃金薯轉化35 d；C為黃金薯轉化55 d；D為黃金薯轉化85 d；E為中薯8號轉化15 d；F為中薯8號轉化35 d；G為中薯8號轉化55 d；H為中薯8號轉化85 d。

2.2 農桿菌介導馬鈴薯組培苗莖段遺傳轉化結果分析

經農桿菌侵染后的中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段，在MS共培養基上28 ℃條件下黑暗培養2 d，轉至愈傷培養基上培養，待愈傷組織完全長出，再轉至分化培養基上直至長出嫩芽(圖2)，待分化出的再生植株長到 2～3 cm時, 從愈傷組織上切下再生苗插入含有Kan的生根培養基中進行生根培養。經過Kan連續篩選，獲得中薯8號莖段轉化抗性植株13株，Desiree莖段轉化抗性植株8株。

2.3 PCR檢測結果分析

中薯8號微型薯和黃金薯微型薯，中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段所獲得的抗性植株進行PCR鑒定，中薯8號微型薯和黃金薯微型薯所獲得的抗性植株分別檢測出2株和3株陽性植株，中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段所獲得的抗性植株分別檢測出2株陽性植株，均擴增出約1 300 bp與陽性對照相對應的條帶，而未轉化的馬鈴薯植株未能擴增出相應條帶。

2.4 農桿菌介導不同馬鈴薯外植體轉化效率分析

在遺傳轉化過程中，馬鈴薯誘導愈傷分化產生抗性芽，經過生根選擇即為抗性植株，試驗分別接種中薯8號微型薯和黃金薯微型薯，中薯8號無菌苗莖段和Desiree各無菌苗莖段各30個，誘導產生抗性芽分別為中薯8號微型薯抗性植株15株，經PCR檢測陽性植株有2株，轉化率為13.3%；黃金薯微型薯抗性植株12株，經PCR檢測陽性植株有3株，轉化率為25%。中薯8莖段抗性株13株，經PCR檢測陽性株有2株，轉化率為15.4%；Desiree莖段抗性株8株，經PCR檢測陽性株有2株，轉化率為25%。

在試驗過程中發現，用中薯8號微型薯、黃金薯微型薯轉化，污染較為嚴重，且需要頻繁的更換培養基，而用無菌的中薯8號和Desiree莖段，污染較微型薯少。并且不同的桿菌濃度，也對試驗過程產生影響，最適農桿菌濃度OD600值為0.4，大于或小于0.4均會導致外植體農桿菌污染嚴重而死亡；另外，在抗性植株生根培養過程中使用IBA的生根效果較IAA好。

注：A為Desiree莖段轉化15 d；B為Desiree莖段轉化35 d；C為Desiree莖段轉化75 d；D為中薯8號莖段轉化15 d；E為中薯8號莖段轉化35 d；F為中薯8號莖段轉化75 d。

注：M為marker；P為陽性對照；C為陰性對照，其中A圖中1～3為黃金薯微型薯轉化陽性植株；圖B中1～2為Desiree莖段轉化陽性植株；圖C中1～2為中薯8號微型薯轉化陽性植株；3和4為中薯8號莖段轉化陽性植株。

表1 農桿菌介導不同馬鈴薯外植體轉化效率分析

3 討 論

農桿菌介導法是應用最早、最實用、有效且有最多成功實例報道的植物轉基因方法，在眾多的轉基因植物中80%是由農桿菌介導轉化的[7]。馬鈴薯微型薯和莖段是農桿菌介導外源基因轉化的理想受體，馬鈴薯高效的遺傳轉化體系具有基因型的依賴性，需根據不同品種、不同基因型和外植體轉化關鍵因素進行優化選擇。有許多關于農桿菌介導馬鈴薯基因遺傳轉化的研究報道，如齊恩芳等[8]以隴薯11號試管薯為材料，成功將PVX、PVS、PVY和PLRV四種病毒CP融合基因導入馬鈴薯；崔少彬[9]以脫毒微型薯為外植體，成功將ODREB2B基因導入中薯3號中，并提高了中薯3號的抗干旱和耐鹽能力。石虎[10]以青薯9號無菌苗為外植體，優化遺傳轉化體系獲得ERFs類轉錄因子抗性植株。本研究以馬鈴薯中薯8號微型薯和黃金薯微型薯，中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段為外植體，通過根癌農桿菌介導方法成功轉化馬鈴薯，并對遺傳轉化中的關鍵因素進行優化。

在馬鈴薯轉化過程中，不同品種、農桿菌的濃度和抗生素的選擇對轉化出陽性植株很重要，這能有效去除農桿菌侵染造成的污染和確保轉化植株的正常生長。作為遺傳轉化的材料，必須來源充足和再生穩定，且在生長狀態最好的時間段進行遺傳轉化。綜合以上因素，通過對馬鈴薯不同品種不同外植體進行遺傳轉化分析，發現馬鈴薯莖段轉化效率相對微型薯高，且工作量和污染相對較少。用微型薯轉化，污染較為嚴重，且需要頻繁的更換培養基。并且在試驗過程發現，最適農桿菌濃度OD600值為0.4，OD600值大于或小于0.4，均會導致外植體農桿菌污染嚴重而死亡。此外，在促進轉化植株生根過程中發現，IBA的生根效果比IAA更好。

本研究獲得的轉FAD2基因馬鈴薯陽性植株進行PCR檢測，確認FAD2基因已經整合到馬鈴薯中，這為后續的遺傳轉化試驗及FAD2的功能驗證和耐凍性鑒定奠定基礎。