丹參種子活力快速測定方法的建立及其與萌發率的相關性

廖 芳， 任瑞花， 孔德英， 劉 偉， 馮 潔， 韓 藝， 李關榮

(1.天津海關動植物與食品檢測中心， 天津 300461； 2.西南大學農學與生物科技學院， 重慶 400716；3.重慶海關技術中心， 重慶 401333)

種子的生活力即種子萌發的潛在能力，是衡量種子質量的重要指標之一[1-2]。種子活力測定是種子檢驗的重要環節，對種子引進、儲藏、交換、播種等生產環節，都有十分重要的意義[3]。種子質量檢驗通常都采用發芽試驗的方法，但發芽試驗時間較長，還會受到水分偏差、病菌的侵入等因素的影響，導致結果不太可靠[4]。因此快速測定種子活力非常重要。目前，種子活力的快速測定方法主要有氯化三苯基四氮唑(TTC)法、紅墨水(或酸性靛藍)法、碘-碘化鉀法、溴麝香草酚藍(BTB)法等[5-7]。TTC法依賴于種胚呼吸脫下的氫使水溶性氯化三苯基四氮唑(TTC)還原為紅色的脂溶性三苯甲腙(TTF)并附著在種胚表面而使活性種胚著色[8-9]，是標準的種子活力快速測定法；紅墨水(或酸性靛藍)法依賴于種胚活細胞的選擇透性不透過紅墨水(或酸性靛藍)而使胚乳著上紅(藍)色[10-12]；碘-碘化鉀法以測定種子主要儲藏物質淀粉的豐度來快速測定種子的活力[3,13]；BTB法利用種胚活細胞呼吸作用放出的CO2擴散使得種粒周圍環境的酸度增加而使酸堿指示劑BTB顯現黃色[13]，其黃色越深則表明種子活力越強。不同特性(大小，成分、物理特性等)的種子，其適宜的快速測定活力方法也不同。彭子模等[13]研究表明，碘-碘化鉀法對蓖麻、油葵、紅花、向日葵、棉花等脂肪類種子生活力的快速測定效果較好, 而靛藍染色法和碘-碘化鉀反應法均不適合用作檀香種子生活力的快速測定[3]。

丹參為我國傳統的大宗藥材之一[14]，其功效包括活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消痛等[15]。丹參種子為三棱狀長卵形的小堅果，長度1.8～2.5 mm，寬1.1～1.6 mm[16]，不適合采用TTC法和紅墨水(或酸性靛藍)染色法來快速測定種子活力，因剝離暴露種胚及胚乳以觀察種胚或胚乳著色情況極為困難，加之丹參種子的果皮表面存在大量粘性物質，包裹種子[17]，吸水膨脹使剝離種胚和胚乳更為困難。目前還未見丹參種子活力快速測定的方法報道。本研究采用BTB來建立丹參種子活力快速測定方法，并通過類原位萌發和常規萌發試驗測定其發芽率，研究丹參種子BTB活力與萌發率之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究采用重慶市武隆區仙女山從四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣引進的白花丹參種子為材料(W-SCHY-W-1)。

1.2 方 法

1.2.1BTB法處理丹參種子的活力觀測

取外觀飽滿、均一的丹參種子用溫水浸泡10 h[17]，隨機取吸脹種子200粒，整齊均勻排布于4個培養皿中(編號為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)，每皿50粒；另取吸脹種子50粒，煮沸20 min，作為對照組，置于編號為ck的培養皿中。將配置的含2% BTB的1%瓊脂溶膠沿著玻棒緩緩倒入上述5個培養皿中，使之呈均勻的薄層覆蓋種粒。將培養皿置于恒溫(25～30 ℃)培養箱中培養，每隔1 h觀察種粒周圍藍色基質的顏色變化；參照ck種粒周邊的顏色，確定活力表現穩定的最適時間。統計4個重復培養皿中種粒周圍的黃色葷圈出現情況，以出現黃色葷圈的總粒數的百分率快速確定種子活力百分數。

1.2.2類原位萌發試驗

將上述經BTB試驗3 h后的ck，Ⅰ～Ⅳ培養皿中的種粒分別取出，類原位(對位)轉移至育苗盤ck，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的相應位置，加入適量的蒸餾水。將育苗盤置于恒溫培養箱中，在光照16 h/黑暗8 h，光照強度8 000 lx，恒溫25 ℃下培養，在處理14 d后統計種子的萌發率。

1.2.3常規萌發試驗

同上述方法進行浸種，隨機取吸脹的種子250粒，其中200粒平均放在含有雙層濾紙的4個培養皿中(編號Ⅰ～Ⅳ)，剩余的50粒種子煮沸20 min作為對照組(ck)，在培養皿中加蒸餾水，保持濕潤，萌發條件和發芽率統計方法同上。

1.3 發芽率的估算及相關性分析、回歸分析

丹參種子發芽率的測定參照國家《農作物種子檢驗規程與國際標準》中的相關規定[6]：

發芽率(%)=(發芽的總粒數/50)×100%。

利用Excel軟件進行快速測定活力與發芽率的相關性分析和回歸分析。

2 結果與分析

2.1 BTB-瓊脂凝膠法處理丹參種子其活力的表現

以煮沸20 min的丹參種子為對照，在含有新制的2% BTB的瓊脂凝膠基質(1%)的培養皿中播種對照和測試丹參種子，觀察種子周圍凝膠基質的顏色變化情況。在BTB試驗的1～3 h內，ck丹參種子外圍基質一直都呈淡藍色層暈圈，而試驗組的4次重復(Ⅰ～Ⅳ)試驗中，部分種子外圍基質呈淡黃色暈圈，且隨處理時間延長，有的黃色葷圈逐漸加深，部分種子仍呈淡藍色，且在處理3 h后比較穩定(圖1 A)。BTB處理3 h種粒周圍基質的局部放大觀察表明，ck煮死種子周圍出現淡藍色，而測試組的種子周圍呈現不同程度的黃色，說明其活力存在差異(圖1 B)。因此，確定BTB法對丹參種子活力估算最適時間為3 h，此時通過統計出現黃色葷圈的種子粒數，可快速測定丹參種子的活力。

注：A為接種在含BTB-瓊脂凝膠基質的培養皿中丹參種子周圍顏色變化；B為局部放大情況；ck為對照(煮沸20 min殺死種子);Ⅰ～Ⅳ為4次重復試驗。

2.2 BTB法估算丹參種子活力

BTB試驗不同時間(1～3 h)，估算具有活力的丹參種子活力百分率(表1)。隨時間的延長，顯示具有活力的種子數逐漸增高，直到3 h時達到最高。

表1 BTB法估算四川紅原丹參種子活力

2.3 類原位和常規萌發發芽率

BTB處理3 h后進行的類原位萌發試驗結果表明，測試組中平均發芽率為53%，同時觀察到黃色葷圈顏色越深的種子，在類原位萌發中表現出萌發越快的特征；常規萌發試驗測定組平均發芽率為70%，而ck均無萌發(表2)。常規萌發的萌發率均顯著高于類原位萌發的萌發率；測試組中的4個重復，其類原位萌發率和常規萌發率均存在較大差異。

表2 四川紅原丹參種子類原位和常規萌發的發芽率

類原位萌發和常規萌發過程觀察表明，常規萌發的萌發率均高于類原位萌發；與常規萌發比較，類原位萌發的小苗較纖細，根較細長，莖較短，子葉不夠粗壯，可能經BTB法測定活力后的種子，其萌發受到BTB的一定程度的影響，這有待進一步研究確認。

2.4 丹參種子BTB法快速測定活力與其類原位和常規萌發的相關性分析

根據本研究建立起的BTB法快速測定丹參種子活力，結合類原位和常規萌發的萌發率結果的相關性分析可知，類原位萌發發芽率(y)與BTB法估算的種子活力(x)的直線回歸方程為y=0.983 5x+1.859 5，R2=0.996(圖3 A)；常規萌發發芽率(y)與BTB法估算的種子活力(x)之間的回歸方程為y=0.347 1x+51.95，R2=0.972(圖3 B)。表明丹參種子萌發率與BTB法測定活力估算值之間存在顯著正相關。

圖3 BTB法估算種子活力與類原位和常規萌發發芽率的線性回歸方程散點圖

3 結論與討論

李暉[18]采用TTC法快速測定高原植物種子活力，用時較短、簡單快捷, 結果可靠。張薇等[5]設置3個濃度的紅墨水溶液和3個濃度的TTC溶液，對10個粳稻品種試驗材料分別浸種4.5、12、24 h以快速測定種子的生活力，結果表明，TTC染色法比紅墨水染色法測定結果更準確。彭子模等[13]比較了4種不同種子活力測定方法，表明TTC法效果較好，方法簡便，適用性廣，對淀粉含量較多的種子測定效果較好，而對于較小的種子，BTB法則更為方便。

本研究前期發現，丹參種子在含0.1%BTB的凝膠中顯現的淡黃色暈圈顏色較淺，主要是因為丹參種子的呼吸強度比較弱，可能還與其種子外有層膠質影響二氧化碳的擴散有關。后來通過BTB的濃度增加至2%，效果較好。 丹參種子在自然條件下的發芽率較低，只有30%～40%，且出苗不整齊[19]。但孫群等[15]通過研究陜西優良農家品種的丹參種子后發現，當年的新種子發芽率達75%以上。

本研究發現，當年產的四川紅原白花丹參種子其類原位萌發試驗的平均發芽率為53%，而BTB法估算具有活力種子的平均百分率為52%，估算結果與實際試驗結果大致相同。這表明，BTB法可以快速測定丹參種子的活力。常規萌發試驗的種子發芽率(平均達70%)總體高于類原位萌發試驗的種子發芽率，可能是因為類原位萌發挑取的種子帶有殘余的BTB瓊脂凝膠或因種子部分損傷所致。本研究采用較高濃度的BTB(2%)可能對類原位種子萌發有某種不利的影響，這有待于進一步研究確認。類原位萌發發芽率與BTB法估算種子活力的直線回歸方程為y=0.983 5x+1.859 5，R2=0.996；常規萌發發芽率與BTB法估算的種子活力之間的回歸方程為y=0.347 1x+51.95，R2=0.972。表明，丹參種子類原位和常規萌發率與本研究建立的BTB法測定活力估算值之間存在顯著正相關。BTB法估算種子活力與類原位萌發結果更接近，而與常規萌發發芽率結果有些許偏差，也可能是因為類原位萌發采用的就是快速活力測定的種子，而常規萌發采用的則是另取的同批次丹參種子。