赤霉素浸種對柴胡種子發芽及內源激素變化的影響

袁夢佳， 楊太新， 孫延超

(河北農業大學農學院/省部共建華北作物改良與調控國家重點實驗室/河北省作物生長調控實驗室， 河北 保定 07001)

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根，按性狀不同，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功效，用于感冒發熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等癥[1]。

近年來，隨著柴胡藥材需求量的增加，人工栽培面積不斷擴大，但柴胡種子存在發芽率低、發芽時間長等問題，導致柴胡生產中播種量較大且難以保證苗全苗勻，嚴重影響了柴胡產量的提高和質量的穩定。種子萌發是一個由多種激素共同調節的復雜過程[2]。脫落酸(ABA)具有誘導種子休眠，抑制種子萌發，抑制赤霉素(GA3)生物合成及其信號傳導等作用，ABA含量的下降又是種子萌發和生長的先決條件[3-5]；GA3在種胚發育過程中的作用是促進種胚周圍的物質軟化和加速胚細胞的生長和分化，并誘導一些酶類的合成與表達，來加快貯存物質的分解和具有胚軸結構物質的合成[6-7]；生長素(IAA)對種子萌發的調控具有雙面性，即適宜濃度IAA促進種子萌發，過高濃度對種子有抑制作用[8]。玉米素苷(ZR)是屬于細胞分裂素一類的植物激素，在植物生長和發育過程中起著重要的調控作用[9-11]。關于GA3浸種影響柴胡種子發芽的研究已有報道，孫延超[12]用不同濃度GA3溶液對柴胡種子進行浸種處理，結果表明，種子的發芽勢和發芽率均呈顯著差異；周潔等[13]研究表明，濃度為100～250 mg·L-1的GA3處理31號柴胡種子，提高了種子的發芽率和發芽勢，且能使萌發啟動日提前。但有關GA3浸種后柴胡種子發芽過程中的內源激素變化未見報道。因此本研究以冀柴1號為試驗材料，研究不同濃度GA3浸種對柴胡種子發芽的影響，測定分析種子發芽過程中ABA、GA3、IAA、ZR的含量變化，為揭示柴胡種子萌發調控及提高柴胡種子發芽率提供理論依據和可行方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試冀柴1號柴胡種子來源于河北省邯鄲市涉縣柴胡種植基地。

1.2 儀器與試劑

BIC-250人工氣候培養箱、BS-223 S電子分析天平、Agilent 1260型高效液相色譜儀、KQ-300 VDV型雙頻數控超聲波清洗器、HG-9240 A電熱恒溫鼓風干燥箱、TDZ 4-WS低速臺式離心機、NAI-DCY-24 F型氮吹儀、MDF-382 E超低溫冰箱。

ABA、GA3、IAA、ZR的標準品均從Solarbio公司購進，甲醇(色譜醇)、娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

分別用濃度為0(ck)、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1和200 mg·L-1的GA3溶液浸泡柴胡種子12 h，進行種子發芽試驗，測定各處理浸種的柴胡種子萌發啟動時間、高峰期、發芽勢及發芽率，分析種子發芽過程中ABA、GA3、IAA、ZR的含量變化。

1.3.1發芽率的測定

取不同浸種處理的柴胡種子進行紙培發芽試驗，每皿100粒，16 h黑暗8 h光照，發芽溫度為20 ℃，每個處理重復3次。每天記錄種子發芽數，計算其發芽勢、發芽率等指標。

發芽勢(%)=(規定時間內發芽種子數/供試種子總數)×100%;

發芽率(%)=(發芽種子數/供試種子總數)×100%。

1.3.2內源激素含量的測定

每個處理分別發芽50皿，每隔0、8、16、24、32 d觀察記錄發芽情況，并將柴胡種子鮮樣置于液氮中速凍，然后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于內源激素檢測。用高效液相色譜法測定種子發芽過程中ABA、GA3、IAA和ZR的含量。

1) 色譜條件：色譜柱AgilentTC-C 18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相A：甲醇，流動相B：pH=3冰乙酸，進行梯度洗脫(表1)；流速1.0 mL·min-1；進樣量每次10 μL；檢測波長為254 nm；柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2) 對照品溶液的制備：精密稱取IAA、GA3、ABA和ZR標準品各0.005 g，用甲醇溶解定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成50 mg·L-1的母液，過0.45 μm有機濾膜，即為混合對照品溶液。

3) 樣品的制備：稱取約1.000 g發芽中的柴胡種子至預冷研缽中,加入預冷的80%甲醇溶液8 mL(加抗氧化劑BTH)，用液氮研磨勻漿，4 ℃避光浸提16 h。浸提液4 ℃ 16 000 r·min-1離心10 min，轉移上清液至10 mL離心管中，加入0.2 g·g-1試樣的PVPP去除酚類等雜質，超聲震蕩40 min過濾，濾液過C 18固相萃取柱，將流出液氮吹至水相(1.5～2.0 mL)。水相用1 mol·L-1檸檬酸調節pH=3.0，加入3 mL乙酸乙酯萃取，超聲震蕩40 min，轉移上部液體至新的離心管氮吹(吹干乙酸乙酯)，之后加2 mL甲醇復溶，過0.45 μm有機濾膜即進瓶樣品，樣品備用[14-15]。

4) 線性關系建立：將混合對照品溶液用0.45 μm有機濾膜過濾，分別精密吸取混合對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。橫坐標為進樣體積，縱坐標為峰面積，繪制標準曲線，并計算出回歸方程：

ABA，Y1=4 810.9x+142(r2=0.999 9)；

GA3，Y2=82.651X+41.383(r2=0.999 3)；

IAA，Y3=787.55x+4.702(r2=0.999 8)；

ZR，Y4=89.121X+68.542(r2=0.999 4)。

1.3.3數據分析

采用Excel 2010軟件進行數據處理，利用軟件SPSS 23.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 GA3浸種對種子發芽的影響

由表2可見，不同濃度GA3溶液浸種處理，使柴胡種子的萌發啟動時間提前1～3 d，萌發高峰期提前1～3 d，種子的發芽勢和發芽率均顯著提高。隨著GA3濃度的增大，種子發芽率呈現先上升后降低的趨勢，150 mg·L-1處理的種子發芽率最高(64.5%)，200 mg·L-1處理的發芽率降低(41.7%)；種子發芽勢表現相同的變化趨勢，150 mg·L-1處理的種子發芽勢最高(30.1%)，200 mg·L-1處理的發芽勢降低(17.4%)。

表2 不同浸種處理的柴胡種子發芽狀況

2.2 種子發芽過程中內源激素含量的變化

2.2.1種子發芽過程中的ABA含量變化

不同濃度GA3浸種處理的柴胡種子，發芽過程中的ABA含量變化基本一致，均呈“下降-上升-下降”的變化趨勢(表3)，且均顯著降低了柴胡種子發芽過程中的ABA含量，其中以150 mg·L-1處理的作用最為明顯。未萌發時，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的種子ABA含量分別為160.33 ng·g-1、154.41 ng·g-1、154.36 ng·g-1、140.00 ng·g-1，比對照分別下降了6.93%、10.37%、10.40%、18.73%。第16天時，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的ABA含量在種子發芽過程中均最低，分別為36.61 ng·g-1、34.98 ng·g-1、30.77 ng·g-1、38.56 ng·g-1，ABA含量降幅最大，比對照分別下降了30.92%、34.00%、41.94%、27.25%。

表3 不同浸種處理柴胡種子發芽過程中的ABA含量

2.2.2種子發芽過程中的GA3含量變化

由表4可知，0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1浸種處理的種子GA3含量變化基本一致，均隨發芽時間呈“降-升-降-升”的變化，分別在發芽第8天和第24天出現2個低峰值，200 mg·L-1處理的種子GA3含量一直呈逐漸下降趨勢，發芽第32天時最低。不同GA3浸種處理均顯著增加了柴胡種子發芽過程中的GA3含量，未萌發和發芽第8天均以200 mg·L-1處理的最高，分別為16.50 ng·g-1、15.61 ng·g-1；發芽16 d后均以150 mg·L-1處理的最高，發芽16 d、24 d、32 d分別為14.71 ng·g-1、9.31 ng·g-1、9.87 ng·g-1，比對照分別增加了283.07%、233.69%、166.76%。

表4 不同浸種處理柴胡種子發芽過程中的GA3含量

2.2.3種子發芽過程中的IAA含量變化

由表5可見，對照的IAA含量變化呈“下降-上升”趨勢，未萌發時最高，為56.01 ng·g-1，第24天降至28.27 ng·g-1，第32天回升至31.74 ng·g-1。50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的IAA含量變化基本一致，均呈“降-升-降-升”趨勢，分別在發芽第8天和第24天出現2個低峰值。不同GA3浸種處理均顯著降低了柴胡種子發芽過程中的IAA含量，未萌發時50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的IAA含量分別為48.56 ng·g-1、47.44 ng·g-1、33.88 ng·g-1、32.00 ng·g-1。第24天時，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的IAA含量在種子發芽過程中均最低，分別為25.26 ng·g-1、25.32 ng·g-1、21.67 ng·g-1、18.01 ng·g-1，比對照分別下降了10.65%、10.44%、23.35%、36.29%。

表5 不同浸種處理柴胡種子發芽過程的IAA含量

2.2.4種子發芽過程中的ZR含量變化

不同濃度GA3浸種的柴胡種子發芽過程中ZR含量均呈“升-降-升”的變化(表6)。與對照相比，其他處理均顯著增加了柴胡種子發芽過程中的ZR含量，其中以150 mg·L-1處理的作用最為明顯。未萌發時，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1的ZR含量在種子發芽過程均最低，分別為4.99 ng·g-1、4.98 ng·g-1、5.62 ng·g-1、4.64 ng·g-1，第16天時均最高，分別為7.54 ng·g-1、7.59 ng·g-1、7.81 ng·g-1、7.79 ng·g-1，比對照分別增加了2.45%、3.13%、6.11%、5.84%。

表6 不同浸種處理柴胡種子發芽過程中的ZR含量

2.2.5種子發芽過程中的激素比值變化

柴胡種子在發芽過程中IAA+GA3+ZR/ABA比值見表7，不同濃度GA3浸種處理的IAA+GA3+ZR/ABA比值均為“升-降-升”的變化。未萌發時，150 mg·L-1處理的激素比值為0.362，顯著低于其他處理，發芽第8天之后，150 mg·L-1處理的激素比值均顯著高于其他處理，其中第16天最高，為1.094，比對照增長了111.20%。50 mg·L-1處理的激素比值與100 mg·L-1處理的差異不顯著。

表7 不同浸種處理柴胡種子發芽過程中的IAA+GA3+ZR/ABA比值

2.3 種子內源激素與種子發芽率的相關性分析

不同浸種處理的柴胡種子內源激素含量和發芽率的相關性分析結果(表8)表明，種子的ABA含量與發芽率呈極顯著負相關，相關系數為-0.825。GA3含量、IAA+GA3+ZR/ABA比值與種子發芽率均呈現極顯著正相關，相關系數分別為0.968、0.849。ZR含量與種子發芽率呈顯著正相關，相關系數為0.443。IAA含量與種子發芽率的相關系數為0.423，兩者未達到顯著相關水平。

表8 柴胡種子發芽率與內源激素的相關系數

3 小結與討論

GA3作為一種信號物質，在促進種子發芽過程中發揮著重要作用，主要有加速細胞分裂、促進成熟細胞伸長的作用[3-5]。本研究結果表明，不同濃度GA3溶液浸種處理均能顯著提高柴胡種子的發芽勢和發芽率，且均以150 mg·L-1處理的最高，發芽勢和發芽率分別為30.1%、64.5%。

種子發芽與其內源激素的含量變化密切相關[6-7]，GA3具有拮抗ABA的作用，通過增強種胚的活力來促進種子萌發[8,11]。本研究發現，與對照相比，不同濃度GA3浸泡的種子發芽過程中ABA含量均顯著降低，GA3含量均顯著增加，表明GA3浸種在降低柴胡種子ABA含量的同時提高了GA3含量，從而使柴胡種子朝著有利于發芽的方向發展。此結果與王寧等[10]、宋發軍等[11]的研究結論一致。另外，不同濃度GA3浸種處理的IAA含量均低于對照，且IAA含量與柴胡種子發芽率的相關系數為0.423，未達到顯著水平，這與韓志龍等[16]用GA3處理駝絨藜種子的研究結論不相符，有待進一步探討。種子ZR含量與ABA含量變化趨勢相反，ABA含量下降時，ZR含量上升，此結果也與王寧等[3]的研究結論基本一致。

影響種子發芽和休眠的內源激素可能不是單獨起作用的，而是受到激素間交互作用的影響，特別是促進與抑制生長激素之間的比例對種子發芽具有重要意義[3,17]，GA3可以通過影響種子內源激素含量及其比值變化從而促進種子發芽[18-20]。本研究結果表明，柴胡種子發芽過程中，不同濃度GA3浸種處理的IAA+GA3+ZR/ABA比值均顯著高于對照，且該比值與種子發芽率呈極顯著正相關，相關系數為0.849。表明GA3處理可能通過調節IAA+GA3+ZR/ABA比值上升，進而促進柴胡種子發芽。