不同貯藏溫度和時間對思茅松花粉活力的影響

付 強，陳 偉，李 江，馮 弦，史富強，陳紹安

（1.云南省林業和草原科學院，云南昆明 650201；2.普洱市林業和草原種苗工作站，云南普洱 665000；3.普洱市林業科學研究所，云南普洱 665000）

思茅松（Pinus kesiyavar.langbianensis）是一種鄉土材脂兼用樹種，主要分布在云南省哀牢山以西的南亞熱帶山區，具有生長快、耐貧瘠、材質優和產脂高等特點，是云南林產業的明星樹種[1]。圍繞思茅松已形成林化、林板及林槳紙等產業[2]。目前，思茅松的研究主要集中在人工林培育[2]、生態學[3]、碳匯計量[4]和功能基因的克隆與分析[5]等方面，在良種選育方面較為滯后，仍處于一代種子園階段，與馬尾松（Pinus masonnianna）、杉木（Cunninghamia lan?ceolata）等全面進入高世代育種的針葉樹種相比，差距較大，不能有效地支撐思茅松下游相關產業的快速發展。

雜交育種是培育新品種最有效和最常用的手段之一[6]，是思茅松種質創新的一條重要途徑，也是高世代育種的基礎。花粉是種子植物在自然條件下遺傳信息交流的載體[7-9]，花粉受精過程能否順利完成是植物雜交育種的關鍵。在實踐過程中，計劃進行的交配經常會遇到花期不遇的問題，或需要在異地開展雜交工作，對花粉進行有效的保存至關重要，花粉的研究也成為遺傳改良的重要研究內容之一。評價花粉保存成效的最有效手段是測定花粉活力。目前，對于思茅松花粉的研究，僅見陳偉等[10]對思茅松花粉離體萌發條件的研究，以及付強等[11]對思茅松花粉快速測定方法的比較，尚未見有關思茅松花粉貯藏方法的研究報道。本研究在優化思茅松花粉活力測定方法的基礎上，對思茅松花粉貯藏條件進行探索，旨在為思茅松雜交育種工作的順利開展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

思茅松花粉來源于云南省景谷縣文郎林場思茅松無性系種子園（100°29′E，23°29′N），于2003年7月建成，海拔1 600 m。花粉成熟后會從雄球花上自然散落，依此判斷花粉的成熟度并采集材料。2019年2月，從同一植株4 個方位枝條上采集頂端開始散粉的雄球花，將雄球花放入大號紙袋中帶回實驗室，在硫酸紙上攤開，自然陰干散粉，過篩后的花粉經硅膠干燥72 h后儲存于密封瓶中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉萌發率測定時間的確定

采用離體培養法測定萌發率，培養基為100 mg/L H3BO3溶液。以當年新鮮的思茅松花粉為材料，在2 mL 的離心管中加入1 mL 的培養基，再加入10 mg花粉，震蕩離心管，讓花粉粒與培養液充分混合，隨后將離心管置于28 ℃的培養箱中暗培養12、24、36、48、60 和72 h 后取樣，震蕩離心管，用吸管吸取樣品置于載玻片上，蓋上蓋玻片進行鏡檢[10]。觀測花粉的萌發過程，統計萌發率，測量花粉管長度，確定測定的最佳時間。每處理設4個重復。

1.2.2 貯藏條件對花粉萌發率的影響

將新鮮制備好的花粉分裝于底部放有變色硅膠的密封瓶中，標記后分別置于常溫（室溫）、4、-18和-80 ℃條件下保存，0.5年和1年后分別取樣，于28 ℃恒溫箱暗培養48 h，統計花粉的萌發情況。每處理設4個重復。以貯藏前的花粉萌發率測定值為對照（CK）。

1.2.3 指標測定

采用Leica顯微鏡（DM2500，德國）進行鏡檢，使用其自帶的數碼成像系統進行拍照，每張樣片隨機觀察4 個視野，單個視野花粉數量大于50 粒。當花粉管長度大于花粉粒直徑時為花粉萌發，花粉管長度是花粉萌發的判斷依據，也是判斷花粉活力大小的重要指標。利用成像系統自帶的測量工具測量萌發花粉粒的花粉管長度。

花粉萌發率= 觀察視野萌發的花粉數/觀察視野花粉總數×100%

1.3 數據處理

采用Excel 軟件進行處理與分析，采用DPS 18.10軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 思茅松花粉萌發率測定時間

12 h可觀測到思茅松花粉萌發，萌發率為4.8%；隨著培養時間的延長，萌發率逐漸升高，36～48 h 急劇升高，48 h 后趨于平穩，48、60 和72 h 的萌發率差異不顯著（表1）。12 h 萌發花粉粒花粉管的平均長度為55.1 μm（花粉粒的平均直徑為49.8 μm）；隨著培養時間的延長，花粉管的長度不斷伸長，48 h 萌發花粉粒花粉管的平均長度為98.1 μm，約為花粉粒直徑的2 倍；72 h 萌發花粉粒花粉管的平均長度為182.8 μm；48 h后萌動的花粉粒，花粉管長度較少能達到萌發標準。

表1 思茅松花粉在不同培養時間的萌發情況Tab.1 Pollen germination of P.kesiya var.langbianensis in different culture time

2.2 貯藏條件對花粉萌發率的影響

0.5年時，4 種貯藏方式的花粉萌發率均有不同程度的降低（表2）。其中，常溫干燥貯藏的花粉萌發率最低（19.2%），比CK（圖1a）降低69.7%；隨著溫度的降低，花粉萌發率逐漸升高，超低溫（-80 ℃）干燥保存的花粉相對不容易失活，與CK 相比降低29.8%～36.1%（圖1b～e）。方差分析和多重比較表明，不同貯藏方式間的花粉萌發率差異極顯著（P＜0.01），3 種低溫干燥貯藏方式間的花粉萌發率差異不顯著。

表2 不同貯藏方式花粉萌發率（0.5年）Tab.2 Pollen germination rate of different storage methods(0.5 years)(%)

1年時，4 種貯藏方式的花粉萌發率大幅降低（表3）。其中，常溫干燥貯藏的花粉萌發率僅為2.3%，與0.5年時相比降低88.0%，與CK 相比降低96.4%，絕大多數花粉已經失去活力；超低溫干燥貯藏的花粉萌發率僅為25.5%，3種低溫干燥貯藏的花粉萌發率與CK 相比分別降低了63.7%、63.7%和59.7%（圖1f～i）。方差分析和多重比較顯示，各處理間差異極顯著（P<0.01），3 種低溫干燥貯藏方式間的花粉萌發率差異不顯著。

表3 不同貯藏方式花粉萌發率（1年）Tab.3 Pollen germination rate of different storage methods(1 year)(%)

圖1 不同貯藏方式思茅松花粉萌發情況（28 ℃，48 h）Fig.1 Pollen germination of P.kesiya var.langbianensis in different storage methods(28℃,48 h)

3 討論與結論

花粉活力測定常用的方法有染色法和離體萌發法。染色法具有簡便快速的特點，但準確性差[12]；離體萌發法根據花粉離體培養時的萌發率判斷其生活力[13]，被認為是花粉活力測定最可靠和穩定的方法[14]。離體萌發法中，影響花粉萌發的因子較多，如培養基成分、pH值、培養溫度和時間等，篩選出最優的培養條件需進行大量試驗；其次，離體萌發法進行花粉測定所需時間較長，在確保準確性的前提下，盡可能地縮短測定時間，是離體萌發法需要優化的方向。本研究在初步優化出最適培養基的基礎上，探討測定萌發率的最佳時間。48 h 前花粉的萌發率持續增加，48 h后花粉萌發率無顯著變化，說明花粉粒萌發高峰已過。繼續觀察48 h 后花粉的萌發形態，發現新萌動的花粉粒極少，且花粉管長度未達到萌發標準，說明新萌發的花粉粒較少；48 h后花粉管開叉生長且交錯的幾率增加，導致無法測量花粉管長度。從另一方面說明48 h 為統計花粉萌發率的重要時間節點。48 h時花粉管長度接近花粉粒直徑的兩倍，能直觀地從花粉管長度判定花粉萌發情況，也能準確測量花粉管長度，所以48 h 是本試驗最佳的花粉活力測定時間。

花粉活力的保持一方面由遺傳因素所決定，另一方面受環境因素的影響[15]。有些物種的花粉在適當的溫度和干燥條件下可以保存數年[16]，如細葉按（Eucalyptus tereticornis）花粉經干燥和抽真空處理，在-18～-20 ℃條件下貯藏42 個月后萌發率仍能達到66.4%[17]；松屬的班克松（P.banksiana）在2 ℃和25.75%相對濕度條件下貯藏1年后，其花粉萌發率幾乎無變化[16]；汪企明等[18]對松屬6種松樹花粉的研究表明，干燥后的花粉在低溫、真空條件下貯藏6個月后，花粉萌發率的降幅均低于5%，16 個月后花粉萌發率降幅達11%～55%，說明條件適宜時，松樹花粉可長時間貯藏。本研究的思茅松花粉在低溫干燥條件下貯藏6 個月后，花粉萌發率降低29.8% ～36.1%，遠高于汪企明等[18]的研究結果，可能是因為樹種的差異，也可能是貯藏條件中氧氣含量的差異所致。本研究的所有貯藏方式均未進行抽真空處理，呼吸作用是細胞有活性的一個特征，氧氣含量的降低會抑制花粉粒的呼吸作用，能延長花粉壽命，推測低溫、干燥和低氧環境可能是延長思茅松花粉貯藏時間的關鍵因子。

思茅松花粉在低溫干燥條件下貯藏1年后，花粉萌發率可保留25%左右，相較于貯藏前，雖然花粉萌發率降低達63.7%，但仍然具有一定的應用前景。松屬植物在開展人工輔助授粉時，鮮花粉常添加填充劑，花粉與填充劑的比例為2∶8 或3∶7[16]，保存的松屬植物花粉萌發率與思茅松低溫干燥保存1年后花粉萌發率相近，說明低溫干燥保存方式已能滿足生產上的使用，當花粉需要隔年使用時，可使用該簡易方法進行花粉貯藏。

以100 mg/L H3BO3溶液為萌發培養基，在28 ℃恒溫條件下暗培養，12 h 可觀測到思茅松花粉粒萌發，48 h后花粉萌發率趨于平穩，且具有較好的花粉萌發識別度，48 h 是該試驗條件下花粉活力測定的最佳時間。4 種方式貯藏1年后，花粉活力降低59.8%～96.4%，低溫干燥相較于常溫干燥更有利于思茅松花粉萌發率的保持，3 種低溫干燥貯藏方式間花粉萌發率的差異不顯著，低溫干燥保存1年的思茅松花粉萌發率能滿足生產的要求。