一株放射型根瘤菌發酵產物分析

劉詠梅，沈 路，孔 琪

（泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300）

多糖是由糖苷鍵連接的，由多個單糖組成，結構多變，類型多樣，是生命體保持活力健康的重要原因。因此，多糖與核酸、蛋白質和脂質一起被譽為“生命的基礎”[1]。有些多糖是動植物體的重要組分，具有儲藏能量的作用。一方面，雖然來源種類多樣，但提取、純化成本高，且原材料受季節因素限制；另一方面，微生物的發酵時間較短，季節的變化不會影響其生產發酵，所得產物提取簡便。

微生物多糖是經微生物發酵生成的胞內、胞外多糖或從微生物細胞中提取的多糖的總稱，由微生物分泌至胞外并形成黏液或莢膜的多糖被稱為微生物胞外多糖（Extracellular Polysaccharide，EPS）。許多微生物產可溶性或不溶性胞外多糖[2-3]。微生物多糖具有獨特的屬性，這些屬性在植物多糖中是不存在的[4]。微生物多糖憑借其物理特征和流變特性，有增稠、乳化等作用，在許多領域得到應用[5]。因此，EPS得到了廣泛關注。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter）（CFCC2272，中國林業微生物保藏管理中心）。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、酵母膏、瓊脂、蛋白胨、碳酸鈣、牛肉浸膏、苯酚紅等（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.3 儀器與設備

電子天平，生化培養箱，全溫搖瓶柜，超凈工作臺，分析天平，手提式壓力蒸汽滅菌器，臺式高速離心機。

1.1.4 培養基

種子培養基：蔗糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 1.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L。

發酵培養基：蔗糖20.0 g，酵母粉1.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 L。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

在斜面培養基上接根瘤菌，在30 ℃下培養24 h后備用。

于斜面培養基取1環菌，接入種子培養基，在28 ℃、 180 r/min條件下搖瓶培養1 d后備用。

1.2.2 多糖提取

取20 mL發酵液，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入3倍體積95%乙醇沉淀，獲得多糖粗產物。

1.2.3 產物純化

采用Sevage法除蛋白（兩次），95%乙醇沉淀，收集產物，在200～400 nm波長范圍內掃描，樣品中的蛋白去除后冷凍干燥。

2 實驗結果

2.1 菌體形態特征

圖1、圖2分別為根瘤菌CFCC2272在發酵培養基中培養2 d后的形態及電子顯微鏡下的形態。由圖1可見，在發酵培養基平板上，菌落表面形成一層厚厚的多糖產物；圖2顯示，該菌大小為（0.8～1.2）×（1.5～2.5） μm，且細胞外部有多糖分泌。

圖1 根瘤菌CFCC2272菌落特征

圖2 根瘤菌CFCC2272電子顯微鏡照片

2.2 胞外多糖紅外光譜

紅外光譜已經成為化合物鑒定的方法之一。對于混合物而言，峰形代表混合物的變化，會引起分子振動和轉動的變化，也可能導致紅外光譜整體譜圖的變化[6]。

利用菌株發酵培養90 h后，離心收集上清液，采用Sevage法提純并冷凍干燥獲得產品。取多糖樣品與KBr混合，研磨制片。圖3為根瘤菌CFCC2272胞外多糖紅外光譜圖。由圖3可知，在3 500～3 000 cm-1范圍內有一特征吸收峰，最大吸收峰在3 143 cm-1附近，此處為O—H鍵伸縮振動吸收峰，說明產物中有大量O—H基團存在。在1 684 cm-1附近有酰胺特征吸收峰，為酰胺結構中C=O雙鍵伸縮振動吸收峰。1 400 cm-1附近的吸收峰可能為仲酰胺基團中的C—N鍵伸縮振動引起[7]。從紅外光譜圖可以看出，與放射型根瘤菌吸收峰特征相契合。

圖3 根瘤菌CFCC2272胞外多糖紅外光譜