miR-223靶向RhoB抑制Aβ1-42誘導的海馬神經元凋亡

張峪涵，付暉，劉翠娟，廖成鉅，羅昊棟

(1.東莞市松山湖中心醫院 神經內科，廣東 東莞 523326; 2. 廣東醫科大學 藥學院，廣東 東莞 524023)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老有關的神經退行性疾病[1]。其主要病理特征是相關腦區中神經纖維纏結和由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)組成的老年斑沉積[2]。Aβ寡聚體沉積具有神經毒性，可促發神經元凋亡，是引發AD的重要機制之一[3]。微小RNA(miRNAs)是一類長21～23個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，廣泛存在于人類大腦組織中，與神經元凋亡、增殖、分化等有關[4]。miR-223是miRNA的一種,因在很多惡性腫瘤或炎癥組織中呈低表達而受到普遍關注[5]。2020年，Serpente等[6]通過研究AD進展過程中miRNAs網絡的變化發現，與健康人群相比，miR-223在AD患者腦脊液和血液樣本中表達量顯著下調。但是，miR-223的特異性作用機制，如AD的相關靶點和通路尚未完全清楚。本研究以寡聚態Aβ1-42誘導的海馬神經元為研究模型，通過調控miR-223和RhoB的表達來觀察其對神經元細胞凋亡的影響，為AD的預防或治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級新生1 d的SD雄性大鼠12只，購自山西省腫瘤研究所。實驗動物許可證號：SCXK(晉)2017-0001。

1.2 主要儀器及試劑

CO2細胞培養箱購自美國Forma Scientific公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國 Beckman Coulter公司，0.25%胰酶/EDTA、Aβ1-42、多聚右旋賴氨酸購自Sigma公司，PCR引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體、RhoB單克隆抗體、β-actin單克隆抗體和二抗均購自賽信通(上海)生物試劑有限公司, miR-223 mimics、mimics control、si-RhoB和si-con均購自百奧邁科生物技術有限公司,轉染試劑Lipofectamine2000購自上海陽光生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海馬神經元細胞分離和培養 用體積分數75%乙醇消毒SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(5 ml·kg-1)麻醉后，斷頭取全腦，在無菌條件下分離海馬組織。本研究得到了醫院倫理委員會的批準。將海馬組織置于預冷磷酸鹽緩沖液中，去除血管和筋膜后切成1 mm3小塊。用含15% 胎牛血清的DMEM/F12懸浮海馬神經元。以1 000 r·min-1離心5 min后，將海馬神經元重新分散于DMEM/F12(15%FBS)中，密度為3× 105ml-1。將海馬神經元接種至多聚賴氨酸預先包被的6孔細胞培養板中，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中孵育24、72 h。后更換為含有阿糖胞苷(質量濃度為2.5 mg·L-1)的新鮮培養基代替(阿糖胞苷能抑制成纖維細胞和膠質細胞的生長)。連續培養海馬神經元7 d，倒置顯微鏡下觀察其形態學變化。

1.3.2 海馬神經元細胞免疫熒光染色 將海馬神經元接種于6孔板中，孵育7 d后用4%多聚甲醛固定20 min。10%山羊血清白蛋白阻斷非特異性結合位點30 min，4 ℃條件下用小鼠抗大鼠微管相關蛋白(microtubule-associated protein-2，MAP-2)單克隆抗體孵育12 h，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗鼠IgG二級抗體室溫培養2 h。用Hoechst 33258(50 g·ml-1)逆染1 h。清洗3次，干燥過量液體后倒置熒光顯微鏡觀察海馬神經元。在同一視野內，用不同的激發光分別獲得神經元和神經元核的熒光圖像。使用Image Pro 6.0軟件測量每個視野海馬神經元的最長神經突長度。

1.3.3 細胞轉染 將生長狀態良好的神經元細胞隨機分為空白組(不作任何轉染處理)、陰性組(轉染miR-NC)、miR-223-m組(轉染miR-223 mimics)、miR-223-m+LV組(轉染miR-223 mimics+慢病毒骨架)、miR-223-m+LV-RhoB組(轉染miR-223 mimics+RhoB過表達載體)。參照脂質體 LipofectamineTM2000 說明書操作步驟轉染細胞。轉染后繼續培養24 h，用于后續試驗。

1.3.4 寡聚態Aβ1-42的制備及應用 參考文獻[4]制備寡聚態Aβ1-42：取1 mg凍干粉Aβ1-42經有機溶劑HFIP室溫孵育1 h處理后真空風干，用少量DMSO助溶后溶解于無血清的DMEM-F12低糖培養基中,配成100 μmol·L-1濃度的母液，4 ℃孵育24 h后，每組轉染后的細胞加入Aβ1-42寡聚肽片段30.0 μmol·L-1孵育48 h。

1.3.5 MTT法檢測細胞存活率 將密度為1×103ml-1海馬神經元接種于96孔板上，每孔接種100 μl(含2.5 mg·L-1阿糖胞苷)。培養24 h后，用不同濃度的Aβ1-42(0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)誘導海馬神經元。以0 μmol·L-1Aβ1-42為陰性對照。培養48 h后加入20 μl·孔-1MTT溶液(5 mg·ml-1)，37 ℃培養4 h，加入150 μl二甲基亞砜，振動10 min，促進紫晶完全溶解。在微板閱讀器上檢測每個孔490 nm的吸光度(OD490 nm)值，計算每組海馬神經元的存活率。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 每組轉染后的細胞加入Aβ1-42寡聚肽片段30.0 μmol·L-1孵育48 h。將各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，離心收集，加入200 μl緩沖液制備細胞懸液。分別加入5 μl 的Annexin V-/FITC和PI混合均勻，室溫避光孵育15 min后，再次加入200 μl緩沖液，置于流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測 構建 WT-RhoB(含RhoB 3′UTR片段)和MUT-RhoB(含RhoB 3′UTR片段突變體)的熒光素酶報告載體，采用LipofectamineTM2000分別將WT-RhoB及MUT-RhoB與miR-223 mimics、miR-223 inhibitor或miR-NC共轉染。轉染后培養24 h，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術說明書操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發值，以兩者的比值評價RhoB基因的激活程度。

1.3.8 qRT-PCR實驗 用TRIzol液裂解細胞后，提取總的RNA。取1 μg RNA按反轉錄試劑盒說明書用于合成cDNA。取1.0 μg cDNA用Fast Start Universal SYBR Green Master mix試劑盒進行PCR擴增，預變性95 ℃ 10 min，隨后40個循環(變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 34 s)。miR-223引物：正向5′-TCCGAAGTGTACCTCAAC-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6 mRNA引物：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。RhoB mRNA引物：正向5′-AGTAAGGACGAGTTCCCCGA-3′，反向5′-GGTGAAGGGCGAACATCTGA-3′。GAPDH引物：正向5′-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′，反向5′-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGATG-3′。miR-223表達歸一化為U6， RhoB mRNA表達歸一化為GAPDH。采用2-ΔΔCt法對數據進行處理。

1.3.9 Western blotting實驗 將細胞加入適量RIPA裂解液裂解后，提取總蛋白，并用BCA法測定神經元中的蛋白量。提取的蛋白與loading buffer充分混合后，置于100 ℃煮沸5 min，變性后進行蛋白質電泳。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h后，加入Ⅰ抗[caspase-3(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、RhoB(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)]4 ℃ 孵育過夜。次日，Ⅱ抗37 ℃孵育2 h后顯影。

1.4 統計學處理

應用SPSS 21.0軟件包進行數據分析處理，所有數據均以平均值±標準差表示。兩組間比較采用雙尾t檢驗；多組間比較采用方差分析或單因素重復測量的方差分析，然后采用SNK-q法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次。

2 結 果

2.1 海馬神經元分離培養和鑒定

培養4～6 h，大部分海馬神經元粘連形成突觸。相鄰神經細胞突觸間的神經網絡在3～7 d形成。海馬神經元分布均勻，胞體完全伸展，呈錐體狀，有長軸突和1～2個樹突。用神經元特異性標志物(MAP-2)進行熒光標記后，顯示海馬神經元純度達(94.2±3.6)%，可滿足進一步實驗的要求(圖1)。

A. 接種后3 d、4～6 h、7 d時海馬神經元形態學觀察； B. 免疫熒光雙染法觀察大鼠海馬神經元特征

2.2 Aβ1-42對海馬神經元存活率的影響

經MTT法檢測，不同濃度的Aβ1-42(0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)誘導海馬神經元48 h時，隨著作用濃度的升高，細胞存活率逐漸降低。當濃度超過30 μmol·L-1時，海馬神經元的活力明顯受到抑制，存活率<80%(F=118.530，P<0.05)(圖2A)。

2.3 Aβ1-42對海馬神經元miR- 223和RhoB表達的影響

經qRT-PCR和Western blotting法檢測，不同濃度的Aβ1-42(0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)誘導海馬神經元48 h時，隨著作用濃度的升高，細胞miR-223相對表達量逐漸降低，同時RhoB蛋白表達逐漸升高(F值分別為39.849、77.243，均P<0.05，圖2B和圖2C)。但是當Aβ1-42≥30 μmol·L-1時，細胞miR-223表達變化不是很明顯，差異無統計學意義(F=1.983，P>0.05)，因此選擇Aβ1-4230μmol·L-1用于后續實驗。

2.4 過表達miR- 223對Aβ1-42誘導海馬神經元細胞凋亡的影響

經qRT-PCR法檢測，miR-223-m組細胞miR-223相對表達量較空白組和陰性組升高(F=68.215，P<0.05)；而與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，miR-223-m+LV-RhoB組RhoB mRNA相對表達量也升高(F=129.650，P<0.05)，說明轉染成功，可用于后續實驗。經流式細胞術法檢測，經Aβ1-42寡聚肽片段30.0 μmol·L-1孵育48 h后，與空白組及陰性組相比，miR-223-m組細胞凋亡率降低；而與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，miR-223-m+LV-RhoB組細胞凋亡率升高(F=11.915，P<0.05)(圖3)。

2.5 過表達miR- 223對海馬神經元RhoB蛋白和凋亡相關蛋白表達的影響

Western blotting法檢測，空白組、陰性組、miR-223-m組、miR-223-m+LV組和miR-223-m+LV-RhoB組RhoB、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達量比較，差異均有統計學意義(F值分別為27.815、18.790、21.331、7.843，P<0.05)；與空白組及陰性組相比，miR-223-m組細胞RhoB、Bax和caspase-3蛋白表達降低，同時Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，而與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，miR-223-m+LV-RhoB組細胞RhoB、Bax和caspase-3蛋白表達升高，同時Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖4。

A. MTT法檢測細胞存活情況；B. qRT-PCR法檢測細胞miR-223相對表達量；C. Western blotting法檢測細胞RhoB蛋白表達情況

2.6 miR- 223與RhoB的靶向關系

通過miRcode預測到RhoB 3′UTR存在2個與miR-223相結合的位點。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-223 mimics分別和含有兩個假定的miR-223結合序列的熒光素酶構建的RhoB 3′-UTR共轉染后，熒光活性顯著降低(F=165.73，P<0.05)，同樣，miR-223 inhibitor與RhoB 3′-UTR共轉染后，熒光活性顯著升高(F=89.435，P<0.05)，表明它們之間存在直接相互作用。見圖5。

3 討 論

隨著近年來對AD發病機制的深入研究，Aβ寡聚體觸發的神經元細胞凋亡引起了大量學者的關注[7]。據報道，Aβ1-42主要用于建立AD細胞模型。本研究原代海馬神經元被成功地分離和培養，而經Aβ1-42處理后可抑制海馬神經元活動，并以劑量依賴性方式促進其凋亡。綜合考慮細胞存活率、miR-223表達量的差異，選用30 μmol·L-1的Aβ1-42以成功地誘導AD細胞模型。miR-223在Aβ1-42轉導的海馬神經元中表達下調，同時RhoB表達上調。進一步的深入研究表明，miR-223通過靶向抑制RhoB蛋白的表達，阻止了海馬神經元的凋亡。

RhoB作為GTPase信號分子家族中的一個較為獨特的分子，通過與下游靶蛋白相互作用，進而誘導多種細胞反應，包括調節肌動蛋白骨架和基因轉錄等[8]。RhoB與RhoA及RhoC一起，共同構成Rho亞家族。Rho亞家族各成員是細胞分裂、細胞遷移、傷口愈合或免疫監視等多種細胞和生理過程中的關鍵介質，其功能失調與不同的人類疾病有關[9]。這3個蛋白質有高度的相似性(87%以上的氨基酸序列具有同源性)。但是與RhoA及RhoC相反，RhoB是由一個外顯子編碼的蛋白分子，它被認為是在脊椎動物進化過程中從RhoA反向拷貝整合而來[10]。目前關于RhoB研究最廣泛的是在腫瘤領域。楊鵬春等[11]通過細胞實驗證實，miR-223可能靶向作用于RhoB，進而影響結直腸癌的發展及轉移。在許多類型的細胞中，RhoB基因表達是由損壞的DNA刺激引起的，說明RhoB可能參與了DNA 損傷信號機制的某些下游水平，進而成為細胞死亡效應器或死亡信號修飾器。他汀類藥物與降低AD的發生風險有關，其可能機制在于抑制類異戊二烯途徑，調節小GTP酶RhoA、B和C分子的活性[12]。因此，小分子RhoB可能是中樞神經系統病理反應最重要的介導因子之一。在中毒或創傷性刺激下，RhoB在神經元中的表達量會迅速上調，RhoB有望成為神經退行性疾病嚴重性的重要預測分子[13]，但是目前關于RhoB在AD進展中的作用尚不明確。

a 與空白組相比，P<0.05; b 與陰性組相比，P<0.05; c 與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，P<0.05

a 與空白組相比，P<0.05; b 與陰性組相比，P<0.05; c 與miR-223-m組相比，P<0.05

圖5 miR-223和RhoB存在靶向結合關系

通過miRcode預測到RhoB 3′UTR存在2個與miR-223相結合的位點；雙熒光素酶報告基因分析也進一步證實了miR-223對于RhoB表達具有一定的靶向調控作用。miR-223參與多種細胞病理過程的調節，如癌癥、自身免疫性疾病和炎癥性疾病。既往miR-223被認為是NLRP3炎癥小體的陰性調節因子。慢性炎癥體激活為神經退行性疾病的一個基本特征，是由包括淀粉樣β蛋白和α-突觸核蛋白在內的錯誤折疊的蛋白質聚集體引起的，導致促炎癥細胞因子的分泌和神經炎癥的傳播[14]。Mancuso等[15]也通過人體血液樣本證實，與健康人群相比，miR-223在AD患者、帕金森患者、輕度認知功能障礙者人群血清中表達量降低。miR-223有望成為鑒別診斷神經退行性疾病的潛在非侵入性生物標志物。在本研究miR-223對Aβ1-42誘導的海馬神經元生物學行為的影響結果提示，miR-223通過抑制RhoB的表達，進而增加海馬神經元活性，并抑制其凋亡，說明miR-223/RhoB軸在損傷神經元修復和再生中具有重要作用，但本研究的不足之處是還未探討RhoB是如何調控Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達量，進而誘導細胞凋亡的。

綜上所述，本研究結果表明，Aβ1-42誘導的海馬神經元中miR-223表達下調，同時RhoB表達下調。miR-223通過靶向抑制RhoB表達阻止AD海馬神經元的凋亡。