支氣管哮喘患兒肺泡灌洗液miR-98-5p及靶蛋白STAT3的表達(dá)與氣道炎癥的相關(guān)性分析

杜明紅，周云，劉成軍

(1.重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院 兒科，重慶 408000; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400000)

支氣管哮喘是兒科最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，目前傳統(tǒng)的治療藥物以控制癥狀、減少發(fā)作頻率為主要目的[1]。對(duì)于疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，例如急性發(fā)作、肺功能下降、長(zhǎng)期用藥引起的不良反應(yīng)等，都應(yīng)納入臨床治療考慮的范疇。由于支氣管哮喘患兒氣道炎癥可能持續(xù)存在，即使臨床癥狀得到緩解，但并不能證明已達(dá)到治療目的[2]。因此，探索新的治療靶點(diǎn)尤其是與氣道炎癥相關(guān)的分子機(jī)制，對(duì)于新型藥物研發(fā)具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。眾多miRNAs被證實(shí)在肺部疾病的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，例如唐晉等[3]發(fā)現(xiàn)miR-98-5p可靶向TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞向M2型分化，從而減輕肺部炎癥并保護(hù)肺泡組織的正常結(jié)構(gòu)及功能。但是miR-98-5p是否可作為支氣管哮喘治療的分子靶點(diǎn)尚需要臨床證據(jù)的支持。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)是miR-98-5p的下游靶蛋白[4]。Chong等[5]已通過(guò)小鼠模型證實(shí)，STAT3與哮喘發(fā)病機(jī)制有潛在聯(lián)系。本研究擬探討支氣管哮喘患兒肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中miR-98-5p和靶蛋白STAT3的表達(dá)變化及其與氣道炎癥的相關(guān)性，為尋找疾病進(jìn)展和臨床療效的評(píng)估指標(biāo)以及將來(lái)靶向藥物的開發(fā)提供一定的證據(jù)支持。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2020年5月于重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院就診的120例支氣管哮喘患兒作為哮喘組，包括72例急性發(fā)作期患兒(BA-E組)和48例緩解期患兒(BA-R組)。其中，男87例，女33例；年齡1～12歲，平均(6.80±3.02)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)。急性發(fā)作期定義為患者臨床癥狀(包括呼吸困難程度、呼吸頻率、脈搏頻率等)和肺功能出現(xiàn)急性或亞急性惡化；臨床緩解期定義為經(jīng)或不經(jīng)治療，癥狀體征消失，肺功能恢復(fù)至急性前水平，并維持3個(gè)月以上。(2) 4周內(nèi)沒(méi)有接受皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或炎癥遞質(zhì)拮抗劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 有變異性哮喘或其他過(guò)敏性疾病史者；(2) 4周內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重感染者；(3) 合并炎癥性疾病、惡性血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤或先天性疾病者。另外納入20例因呼吸道發(fā)育畸形(3例)或支氣管異物(17例)入院就診的患兒作為對(duì)照組，排除感染病史、過(guò)敏性疾病史、免疫疾病史。其中男11例，女9例；年齡1～12歲，平均(6.40±3.19)歲。兩組基本資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；所有參與者的監(jiān)護(hù)人在招募前提供了書面的知情同意書。

表1 3組入組受試兒童臨床資料對(duì)比

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 樣本收集及處理 根據(jù)歐洲呼吸學(xué)會(huì)兒童肺泡灌洗術(shù)的操作指南，所有患兒采用喉罩式氣道和柔性支氣管鏡(Olympus BF-3C160型，日本奧林巴斯公司)在全身麻醉下進(jìn)行灌洗；從右肺葉中段收集灌洗液，1 ml·kg-1·次-1，20～40 min·次-1。將BALF分為兩部分：一部分用于病原學(xué)培養(yǎng)；另一部分離心，取細(xì)胞沉渣用于細(xì)胞學(xué)分析，取上清用于提取總RNA和細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.2.2 提取總RNA并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量 采用mirVana miRNA Isolation Kit(美國(guó)Ambion公司)提取BALF總RNA，使用MicroRNA TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan MicroRNA檢測(cè)(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95 ℃→60 ℃→72 ℃)，收集熒光信號(hào)。數(shù)據(jù)分析使用Livak和Schmittgen等描述的2-ΔΔCt方法。將數(shù)據(jù)用U6 mRNA內(nèi)參校正。凈循環(huán)閾值(net cycle threshold，CT)被用來(lái)計(jì)算每個(gè)樣本的ΔCT值，使用U6 mRNA的平均CT作為參考。U6是miR-106a的內(nèi)參。miR-98-5p正向序列為5′-TGCAGTAGATCTCAAAAAGCTACC-3′，反向序列為5′-CCTTGGCCATGTAAAAGTGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度54 bp；U6正向序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向序列為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為79 bp。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)STAT3和氣道炎癥相關(guān)炎癥因子的表達(dá)量 采用ELISA試劑盒檢測(cè)BALF中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-13、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、總免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)。用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用線性回歸分析確定標(biāo)準(zhǔn)曲線中的細(xì)胞因子濃度。所有實(shí)驗(yàn)均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 肺功能檢查 使用PonyFX型肺功能儀(意大利COSMED公司)對(duì)哮喘患兒的肺功能進(jìn)行檢測(cè)，包括最大程度的深呼吸后用力呼氣第1秒時(shí)候的氣量容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、FEV1/FVC、用力呼氣25%容量(MEF25)、MEF50、MEF75。檢測(cè)前應(yīng)穩(wěn)定患兒情緒，并告知家長(zhǎng)和兒童配合檢查，對(duì)于5歲以下患兒，盡量在患兒熟睡狀態(tài)下連續(xù)完成5次測(cè)試，若無(wú)法配合操作時(shí)，可以使用口服水合氯醛和鼻塞麻黃素滴鼻進(jìn)行鎮(zhèn)靜，但整個(gè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格控制藥物用量。

1.2.5 FeNO檢測(cè) 受試患兒靜坐，進(jìn)行最大呼氣，50 ml·s-1為測(cè)試的呼氣流速，10 s(>6歲)或6 s(≤6歲)設(shè)定為呼出時(shí)間。采用NIOX一氧化氮測(cè)定儀(瑞典尼爾斯公司)檢測(cè)FeNO，檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告分析 先用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-98-5p的靶點(diǎn)為STAT3，為了驗(yàn)證兩者的靶向結(jié)合關(guān)系，將含有miR-590-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型或突變型STAT3 3′-UTR片段克隆到pmirGLO載體(美國(guó)Promega公司)。然后，用脂質(zhì)體2000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)將HEK293T細(xì)胞與pmirGLO載體及miR-98-5p模擬物共轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后，取細(xì)胞進(jìn)行裂解。使用雙熒光素酶報(bào)告測(cè)定系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)檢測(cè)螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度值，以反映不同處理組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組受試兒童BALF中miR- 98- 5p和STAT3水平

與對(duì)照組相比，BA-E組和BA-R組BALF中miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量降低，STAT3水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而且與BA-R組相比，BA-E組miR-98-5p和STAT3水平變化更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試兒童BALF中miR-98-5p和STAT3水平

2.2 生物信息學(xué)分析miR- 98- 5p和STAT3的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)分析(TargetScan和microRNA.org)結(jié)果顯示，miR-98-5p存在與STAT3 mRNA靶向結(jié)合的

A. TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)miR-98-5p和STAT3 mRNA互補(bǔ)的保守序列；B. 雙熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證

保守序列(圖1A)。根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因分析，miR-98-5p顯著抑制包含野生型STAT3 3′-UTR的報(bào)告載體的熒光素酶活性(圖1B)。然而，miR-98-5p對(duì)包含突變體STAT3 3′-UTR的報(bào)告載體的熒光素酶活性沒(méi)有明顯的影響(圖1B)。

2.3 哮喘患兒肺功能、FeNO、氣道炎癥相關(guān)因子檢測(cè)

與BA-R組相比，BA-E組FEV1、FEV1/FVC以及BALF中IL-10水平降低(均P<0.001)，同時(shí)FeNO和BALF中IL-6、IL-13、TNF-α、總IgE水平均增加(均P<0.05)，見表3。

表3 2組哮喘患兒肺功能、FeNO、氣道炎癥相關(guān)因子檢測(cè)結(jié)果

2.4 哮喘患兒BALF中miR- 98- 5p及STAT3與氣道相關(guān)炎癥因子的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，哮喘患兒BALF中miR-98-5p與STAT3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.659,P<0.05)，同時(shí)與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE亦呈負(fù)相關(guān)(均r<0,P<0.001)，與IL-10水平則呈正相關(guān)(r=0.288,P=0.001)；而BALF中STAT3水平與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE均呈正相關(guān)(均r>0,P<0.001)，與IL-10水平則呈負(fù)相關(guān)(r=-0.285,P<0.001)。見圖2。

圖2 哮喘患兒BALF中miR-98-5p及STAT3與氣道相關(guān)炎癥因子的相關(guān)性

3 討 論

氣道炎癥是支氣管哮喘最主要病理特征之一，多與組織損傷、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的大量釋放有關(guān)，可導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和氣道平滑肌重塑[7]。氣道炎癥涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，例如STATs通路等，這可能是影響氣道炎癥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度的關(guān)鍵分子機(jī)制[8-10]。本研究結(jié)果顯示miR-98-5p與STAT3存在靶向結(jié)合關(guān)系，哮喘患兒BALF中miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量降低，同時(shí)STAT3水平升高，且兩者與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE、IL-10等炎癥因子水平存在一定的相關(guān)性，說(shuō)明miR-98-5p/STAT3軸可能是通過(guò)影響炎癥因子參與哮喘的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程。

miR-98-5p在多種疾病中被證實(shí)屬于炎癥相關(guān)miRNAs。唐晉等[3]通過(guò)建立大鼠急性肺損傷模型發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-98-5p可明顯緩解大鼠肺部病理學(xué)改變，降低BALF中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平，同時(shí)增加抗炎因子IL-10的分泌，說(shuō)明上調(diào)miR-98-5p可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)并保護(hù)肺泡組織的正常結(jié)構(gòu)及功能。劉繼紅等[11]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-98可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化早期血管內(nèi)皮損傷過(guò)程。本研究BA-E組和BA-R組哮喘患兒BALF樣本中miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組兒童降低，而且與BA-R組患兒相比，BA-E組患兒BALF樣本中miR-98-5p降低水平更明顯。這些證據(jù)都證實(shí)miR-98-5p可能參與了哮喘發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程。哮喘患兒BALF中miR-98-5p與促炎因子IL-6、IL-13、TNF-α、IgE水平呈負(fù)相關(guān)，而與抗炎因子IL-10水平則呈正相關(guān)，說(shuō)明哮喘患兒BALF中miR-98-5p表達(dá)降低與氣道炎癥反應(yīng)存在一定的關(guān)聯(lián)，可能通過(guò)加重氣道炎癥反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作。

為了探討miR-98-5p在哮喘中的作用機(jī)制，本研究分析了其潛在靶基因之一STAT3在BALF中的水平變化。STATs屬于細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族，在免疫和體液反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[12]。在細(xì)胞因子刺激下，STATs通過(guò)受體相關(guān)JAK激酶家族成員酪氨酸殘基的磷酸化而被激活[13]。Src激酶家族也被證明通過(guò)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)STAT酪氨酸磷酸化；這種磷酸化通過(guò)對(duì)-Tyr-SH2結(jié)構(gòu)域相互作用導(dǎo)致構(gòu)象變化，從而使STATs轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在那里它們與序列特異性、DNA結(jié)合元件結(jié)合以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[14]。Chong等[5]證實(shí)，瘦素可通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)肥胖性哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。Yu等[15]亦證實(shí)，糖皮質(zhì)激素通過(guò)抑制MEK/JAK/STAT信號(hào)通路的激活調(diào)節(jié)ILC2s的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而有效地降低氣道炎癥反應(yīng)，達(dá)到緩解癥狀的目的。 本研究BA-E組和BA-R組BALF樣本中STAT3水平均高于對(duì)照組，同時(shí)BALF中STAT3水平與IL-6、IL-13、TNF-α、IgE均呈正相關(guān)，與IL-10水平則呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明STAT3與促炎因子激活有關(guān)，這與之前的發(fā)現(xiàn)基本一致。通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和雙熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)，STAT3是miR-98-5p的靶標(biāo)之一，而且通過(guò)Pearson相關(guān)性分析，哮喘患兒BALF中miR-98-5p與STAT3呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-98-5p/STAT3軸與哮喘患兒氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)，可能在哮喘中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，miR-98-5p/STAT3 軸被證明與哮喘患者肺通氣功能有關(guān)。這可能是：(1) miR-98-5p表達(dá)降低可激活STAT3等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)提高炎癥細(xì)胞因子水平加重反應(yīng)，從而增加了哮喘急性發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)；(2) miR-98-5p/STAT3 軸也可能通過(guò)招募炎癥細(xì)胞引起支氣管和肺泡細(xì)胞損傷，從而加重肺部炎癥，提高哮喘疾病惡化的風(fēng)險(xiǎn)。因此，局部阻斷STAT3或上調(diào)miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量可能是未來(lái)治療或逆轉(zhuǎn)哮喘的一個(gè)有吸引力的策略。

綜上，支氣管哮喘患兒BALF中miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量降低，同時(shí)STAT3蛋白水平升高，兩者存在一定的靶向調(diào)控關(guān)系。miR-98-5p/STAT3軸的激活在一定程度上可反映患兒氣道炎癥嚴(yán)重程度，進(jìn)而為支氣管哮喘患兒的臨床治療和病情進(jìn)展評(píng)估提供參考。