利妥昔單抗對激素依賴型腎病綜合征患兒T淋巴細胞亞群和尿CD80水平的影響

王汝瓊，林道炯，吳守業，周瓊花，陳金淑

(海南省婦女兒童醫學中心 1.感染科， 2.腎病風濕免疫科，海南 海口 570000)

利妥昔單抗(rituximab，RTX)是一種針對CD20的嵌合型單克隆抗體[1]，用于治療兒童腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)，其主要作用在于消耗 B細胞、抑制輔助性T細胞17亞型(Th17)分化和增加調節性T細胞(T regulatory，Treg)比例。多數患兒對RTX治療敏感，但部分患兒會逐漸出現激素依賴綜合征(steroid-dependent nephrotic syndrome，SDNS)或頻繁復發[2]。NS的復發與Treg比例下調以及Th17/Treg之值失衡有關[3]。此外，共刺激分子CD80在微小病變患兒復發期時尿液中的含量明顯升高，檢測尿CD80水平有望成為早期診斷NS復發的生物學指標[3]。而抗原提呈細胞表達和分泌CD80則受到Treg分化的可溶性細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4和白細胞介素-10水平的影響。因此，NS患兒Treg比例下調以及Th17/Treg之值失衡可能是導致復發患兒尿CD80水平升高的重要原因。本研究旨在前瞻性地分析RTX對SDNS患兒T細胞亞群和尿CD80水平的影響，為尋找有效監測RTX免疫反應的生物學指標提供一定的幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采集2016年3月至2019年10月在本院兒科腎臟病科首次接受RTX治療的28例SDNS患兒的外周血和尿液；患兒年齡≤18歲，排除了激素抵抗型NS患兒[連續口服30 d潑尼松(60 mg·m-2)和靜脈注射3次強的松龍沖擊治療(1 g·1.73 m-2)后，仍持續表現為蛋白尿]。在糖皮質激素誘導緩解期進行1～2次RTX輸注，每劑375 mg·m-2，間隔1周，分別于1個月、12個月(緩解患兒)或復發時(復發患兒)再次采集標本。RTX首次用藥后，強的松龍每1～2周減少0.25 mg·kg-1，3～5個月后停藥。在12個月的隨訪中，復發患兒每日接受強的松龍治療直至緩解，然后連續4周隔日用藥。隨訪期間，患兒沒有接受其他任何免疫抑制藥物治療。每2個月用流式細胞術檢測CD19表達缺失情況。當CD19+細胞少于1%淋巴細胞時，B淋巴細胞被認為完全耗盡。另外選擇28例健康兒童作為對照組，明確診斷排除任何腎臟疾病、免疫系統疾病或急慢性感染，排除激素抵抗、腎功能受損[估計腎小球濾過率<60 ml·(min·1.73 m-2)-1]或在過去6個月內接受過環磷酰胺治療的患兒。本研究獲得本院倫理委員會的批準;采集患兒血樣前都得到了家屬和法定監護人的書面知情同意。

1.2 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分離和培養

采用密度梯度離心法從肝素化血液中分離PBMCs。用PBS將血液樣本稀釋，然后按2∶1的比例緩慢加入含有Ficoll的試管中，以1 500 r·min-1離心20 min(20 ℃)。收集細胞，洗滌后將2×106ml-1PBMCs接種于24孔培養板上，用含有10%胎牛血清、0.03%L-谷氨酰胺、0.36%HEPES緩沖液和1 μmol·L-1巰基乙醇的RPMI 1640培養液培養。用佛波酯(PMA，50 ng·ml-1)、離子霉素(500 ng·ml-1)和莫能菌素(2 μmol·L-1)刺激細胞，在37 ℃、體積分數5%的CO2和90% 濕度條件下培養4 h。胎牛血清購自美國Invitrogen公司，其他試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 多色流式細胞術分析T、B細胞亞群

取EDTA處理的全血樣本，分別用PE-CD19、APC-CD27、Percp-Cy-CD5、FITC-CD4、PE-Cy-CD8、APC-CD25、PE-Cy7-CD127、PE-Cy5-CD45、APC-Cy7-CD45抗體標記。樣品在4 ℃黑暗中孵育30 min。使用1×FACS溶液裂解紅細胞。加入2%多聚甲醛固定，用300 μl PBS緩沖液重懸細胞，用流式細胞術檢測，對Th1、Th2、Th17和Treg進行免疫表型分析。淋巴細胞亞群的絕對計數是使用它們的頻率和全血細胞計數計算出來的，全血細胞計數是在Beckman Coulter全血細胞計數分析儀上測定的。

1.4 尿CD80水平檢測

對超濾濃縮尿樣進行CD80定量分析。用PBS沖洗旋轉柱后，以3 000 r·min-1離心30 min(20 ℃)。回收濃縮尿樣品，保存在-80 ℃下，用ELISA試劑盒測定尿CD80水平。標準品及濃縮尿液樣本檢測一式兩份。CD80的最終值以濃度因子為基礎，以尿肌酐量進行歸一化。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組兒童臨床資料比較

兩組兒童年齡、性別比例、血肌酐水平、血漿蛋白水平及血清白蛋白水平等差異均無統計學意義(P>0.05)。SDNS組尿蛋白/尿肌酐之值高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。SDNS組隨訪12個月，中位隨訪時間為193.5 d(134.3～258.5 d)。其中13例患兒復發，15例患兒緩解，復發率為46.43%。

2.2 兩組T、B細胞亞群和尿CD80水平比較

與對照組相比，SDNS組治療前外周血Th17、Th1、Th2和記憶B細胞絕對計數更高，Treg絕對計數減少，Th17/Treg之值升高，Th1/Th2之值降低，且尿CD80水平也明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組T、B細胞亞群細胞絕對計數和尿CD80水平基線值比較

2.3 RTX對SDNS患兒T、B細胞亞群和尿CD80水平的影響

隨訪過程中，13例患兒復發，15例患兒緩解。經重復測量的方差分析，各指標水平隨時間不斷波動變化，在各個時間存在水平差異。這種波動變化可能對復發存在一定影響：(1) 2個亞組患兒在不同檢測時間點時各指標(除Th1絕對計數)比較差異均有統計學意義(P<0.05)。(2) 2個亞組之間各指標比較差異有統計學意義(P<0.05)。對于緩解亞組患兒，與基線值相比，RTX治療后1個月和12個月時患兒Th17、Th1、Th2、記憶B細胞絕對計數減少，同時Treg絕對計數增加，Th17/Treg之值降低，Th1/Th2之值升高，尿CD80水平也降低(P<0.05)。對于復發亞組患兒，與基線值相比，RTX治療后1個月和復發時Th2、記憶B細胞絕對計數減少，同時Treg絕對計數增加，Th17/Treg之值和尿CD80水平也降低(P<0.05)。另外，與緩解亞組治療后1個月或隨訪12個月相比，復發亞組患兒治療后1個月或復發時Th17、Th2、記憶B細胞絕對計數和尿CD80水平增加，Treg絕對計數減少，Th17/Treg之值升高，Th1/Th2之值降低，差異有統計學意義(P<0.05)。(3)復發亞組患兒Th17、Treg、Th1、Th2絕對計數、Th17/Treg之值以及尿CD80水平較緩解亞組波動范圍小，差異有統計學意義(P<0.05)。記憶B細胞絕對計數在整個監測時間點和組間不存在交互作用(P>0.05)。見表3。

表3 RTX治療對SDNS患兒外周血T、B細胞亞群細胞絕對計數和尿CD80水平的影響

3 討 論

RTX是一種抗CD20的單克隆抗體，通過與CD20抗原結合，能立即破壞CD20+細胞[4]。注射RTX后患者的B細胞基本會損耗，大多數情況下會持續2～8個月。SDNS治療指南[5]建議采用單一的RTX療程，但是仍有部分患者會在注射RTX后12個月內復發，長期緩解率并不能令人滿意。目前對于SDNS患兒使用RTX誘導緩解的機制缺乏了解，使得臨床治療基本上屬于經驗性治療。本研究結果顯示，RTX能夠顯著減少SDNS患兒外周循環中產生IL-17+Th17數量，增加Foxp3+Treg數量，使Th17/Treg之值逐漸降低，并促進Th1向Th2偏移，使Th1/Th2之值升高。RTX對Th17/Treg、Th1/Th2之值的影響與其他T細胞介導的疾病(包括風濕性關節炎和紅斑性狼瘡)的累積證據一致。

最近大量證據表明，免疫細胞數量失衡與SDNS的發病機制有關。Abdel-Hafez等[6]發現，SDNS患兒外周血IgE水平的升高以及IgG1、IgG2水平的降低與特異性反應有關，存在Th2細胞偏移。此外何婧等[7]也證實,NS復發還與Treg比例降低和Th17/Treg之值升高有關。產生IL-17的Th17和表達Foxp3的Treg之間的不平衡在NS的發病機制中起著重要作用[8]。本研究使用RTX治療后1個月Th17/Treg之值降低，但是復發亞組患兒Th17/Treg之值降低程度低于緩解亞組，而且隨后直至復發時，Th17/Treg之值不再繼續降低，有部分患兒還會出現上升趨勢。兩劑量RTX治療后IL-17+Th17數量減少，同時Treg數量增加，但Th17/Treg之值更高者疾病復發風險增加，其調節機制尚不清楚。

除此以外，Th1/Th2不平衡在SDNS中也起到一定的致病作用。Nickavar等[9]等證實，SDNS伴有特異性反應、Th2極化、細胞因子(包括IL-4、IL-6、IL-13)等循環水平明顯升高，但是復發期間IFN-γ+Th1無變化。Stangou等[10]發現，NS患者血清中Th2相關因子(IL-10、IL-13)水平普遍上調，Th1相關因子(IL-2、IFN-γ)水平則普遍下調。這也支持了本研究結果，RTX治療與IL-13+Th2數量明顯下降有關，但是復發亞組患兒IL-13+Th2數量則一直處于較高水平，同時Th1/Th2之值顯著低于緩解亞組患兒。

目前的研究結果表明，當RTX治療后B細胞被耗盡時，它們的快速恢復預示著疾病的復發。這與既往的一些證據基本一致。Sato等[11]指出，B細胞的恢復與復發的風險增加有關。此外B細胞缺乏癥患者復發NS的情況并不常見。最近Kim等[12]報道，B淋巴細胞及其細胞因子在蛋白尿發生中有重要的作用。體外實驗也證實RTX與人HEK293T細胞上的鞘磷脂磷酸二酯酶樣3b受體沒有結合作用，說明RTX與其直接調節足細胞的能力無關。本研究復發亞組患兒記憶B細胞的數量高于緩解亞組患兒，這與之前報道的結果一致。而且對于緩解患兒，新恢復的記憶B細胞大部分是非致病性的，因為他們經歷了中樞免疫耐受。RTX治療可能通過消耗B細胞及相關細胞因子(如IL-6、TGF-β等)，進而影響Th17分化[13]。RTX也被認為通過結合與CD20具有相似結構的肥大細胞FcεRI，抑制肥大細胞依賴的Th17的擴增。B細胞通常會抑制Treg的分化，并放大效應T的功能。B 細胞活化因子促進Treg凋亡，以IL-2依賴的方式抑制其擴增。在B細胞缺乏的小鼠中，Treg的比例得到了提高和功能得到了增強[14]。RTX誘導的其他機制包括抑制B細胞和T細胞之間的CD40-CD40L共刺激相互作用，使Treg轉化為炎癥表型失敗。

本研究復發亞組患兒尿CD80水平升高，這與Bhatia等[14]的研究結果一致。Treg通過CTLA-4和IL-10調節抗原提呈細胞CD80的表達。RTX治療后Treg的增加可能是尿CD80排泄減少的原因。與這個假設一致，患兒在復發期間通常表現為循環CTLA-4和IL-10的減少，同時循環IL-13水平增加。RTX治療后，外周血單個核細胞上細胞因子的表達變化可能與尿CD80水平降低有關。

綜上，本研究結果表明，RTX誘導的記憶B細胞損耗對輔助性T細胞，主要是Th17/Treg之值和Th1/Th2之值有顯著影響，且這種免疫失衡可能與復發有關；RTX治療后尿CD80排泄減少。這些結果說明了免疫系統在SDNS發病機制中的重要性。但是，有必要進行進一步的研究以分析B淋巴細胞和T淋巴細胞之間確切的相互作用，以及B細胞來源的體液反應在疾病發病機制中的作用。此外，還須確定和驗證SDNS使用RTX治療后復發的危險因素。