新型冠狀病毒感染者咽拭子病毒載量與抗體水平的動態分析

胡金曹，沈瀚，陶月，李雷，張永臣，寧明哲

(1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 檢驗科，江蘇 南京 210008； 2.南京中醫藥大學附屬南京醫院/

2019年12月以來，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndro me coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引發的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)在全球范圍內迅速蔓延。2020 年 3 月 3 日，國家衛健委發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第八版修訂版)[1]，增加了抗體血清學檢測作為輔助診斷病毒感染的依據之一。全面了解SARS-CoV-2病毒載量及其針對不同抗原的特異性抗體在COVID-19患者疾病進展中的動態變化，探討病毒載量和抗體水平的相關性，有助于了解抗體在病毒清除和疾病進展中的作用。

本研究回顧性分析19例COVID-19患者從發病當天到發病第50天期間咽拭子SARS-CoV-2的病毒載量及血清針對SARS-CoV-2不同抗原的IgM、IgG抗體水平。

1 材料與方法

1.1 材料

選取南京市第二醫院湯山分院收治的19例COVID-19患者，收集患者不同時間點采集的208份咽拭子及72份血清標本，采集時間為發病后第0～50天。同時收集2019年10月份的健康體檢志愿者的血清標本45份。

1.2 儀器與試劑

瑞士Roche公司生產的Cobas LC 480全自動熒光定量PCR分析儀，美國Bio-Rad公司生產的iMark酶標儀。所用試劑為碩世生物科技有限公司生產的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,批號:20200108)。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料 回顧性分析COVID-19患者的人口學特征(性別和年齡)、流行病學史、主要臨床癥狀和體征、實驗室檢查結果等。本研究已經通過醫院倫理委員會的批準(2020-023-01)。

1.3.2 SARS-CoV-2核酸檢測 采用實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行核酸檢測。擴增基因為 ORF-1ab 基因和 N 基因，對應擴增通道為 FAM 和 VIC，CY5 通道為內標。反應參數：(1) 50 ℃逆轉錄30 min，1個循環；(2) 95 ℃預變性5 min，1個循環；(3) 95 ℃變性10 s，55 ℃退火、延伸檢測40 s，45個循環，收集熒光信號。結果判讀：陽性樣本參考值為FAM、VIC兩個通道同時滿足待測樣本結果Ct值≤35，曲線呈S型；陰性樣本參考值為兩個通道結果Ct值>38或未檢出；可疑樣本有一個通道結果Ct值≤35，其他一個通道35

1.3.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測特異性抗體IgM/IgG 首先，每孔中加100 μl 質量濃度為1 μg·ml-1的體外重組表達并純化的SARS-CoV-2病毒核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP蛋白)、S蛋白受體結合域蛋白(receptor binding domain，RBD蛋白)、刺突糖蛋白S1亞基(spike glycoprotein S1 subunit，S1蛋白)、刺突蛋白細胞外結構域(ectodomain of spike glycoprotein，ECD蛋白)，4 ℃包被過夜。第2天棄液，加入200 μl·孔-1磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)，浸泡1 min，重復3次。用5%脫脂奶粉(PBST稀釋)200 μl·孔-1封閉，37 ℃孵育1 h。隨后再次洗板。將患者血清及陰性對照血清(2019年健康體檢者血清)用PBST緩沖液1∶200稀釋后，每孔加樣100 μl，37 ℃孵育1 h。再次洗板。加入1∶10 000稀釋的羊抗人IgM-辣根過氧化物酶(HRP)或IgG-HRP，37 ℃孵育1 h。再次洗板。每孔加入100 μl 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液，室溫避光顯色5 min。最后，每孔加入100 μl終止液(1 mol·L-1H2SO4)，5 min內比色。用酶標儀讀取OD450 nm值。以2019年疫情暴發前收集的45份健康人的血清作為陰性對照，以檢測的OD450 nm均值加2SD作為cuf-off數值。

1.4 統計學處理

應用統計軟件SPSS 22.0進行數據分析。計數資料用頻數或百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析；非正態分布的計量資料用中位數和四分位數來表示，組間比較采用Mann-WhitneyU法進行非參數檢驗。相關性分析采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 COVID- 19患者的臨床資料

入組COVID-19患者19例(男8例，女11例)，平均年齡47歲。依據《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第八版修訂版)[2]，將COVID-19患者分為COVID-19重癥組(7例中男3例，女4例，年齡31～56歲)和COVID-19輕癥組(12例中男7例，女5例, 年齡42～63歲)。重癥COVID-19患者年齡較輕癥COVID-19患者顯著大(P=0.006)。咳嗽、發熱及肌痛是出現最多的臨床癥狀。14例患者的胸部CT圖像出現斑片影或磨玻璃影，4例患者呈間質改變或實變。見表1。

表1 重癥與非重癥COVID-19患者的流行病學特征

2.2 ELISA法檢測IgM/IgG抗體

利用4種新冠病毒蛋白(S1、ECD、RBD和NP)作為抗原，采取ELISA法檢測COVID-19患者及健康志愿者血清中針對這些蛋白的IgM和IgG水平(圖1)。結果顯示，健康體檢志愿者的血清中針對4種新冠病毒蛋白的IgM和IgG的OD值均顯著低于COVID-19患者。以陰性對照組的檢測平均數±2SD作為陽性cut-off值)，利用4種蛋白作為包被抗原，結果顯示72.2%～93.1%的COVID-19血清標本呈陽性(表2)。其中在IgM抗體中，ECD IgM陽性檢出率最高(93.1%)；而在IgG抗體中，RBD IgG陽性檢較高，檢出率為83.3%。

圖1 利用ELISA法檢測血清中針對4種不同新型冠狀病毒抗原的IgM和IgG水平

表2 72份標本針對不同抗原檢測的IgM/IgG抗體定性結果

2.3 動態檢測重癥和輕癥COVID- 19患者咽拭子病毒載量以及針對4種抗原的IgM、IgG抗體水平的變化情況

重癥患者咽拭子標本中的病毒載量普遍較高，大部分患者對應的抗體隨病程發展有顯著的上升(圖2、3)。所有患者病毒載量與抗體之間大致分為4種情況：(1) 重癥患者(a、b、c、f)和輕癥患者(n、o、q、s)體內高病毒載量與高抗體水平同時存在，發病3周后，病毒載量大幅度降低，甚至消失。這提示盡管患者體內產生了高水平針對新型冠狀病毒的抗體，但是卻無法有效地降低病毒載量。(2) 重癥患者(d、e)和輕癥患者(s)體內病毒載量在抗體出現的初期就已經大幅降低或消失；(3) 重癥患者(f)和輕癥患者(k、l、r)體內的病毒載量一直較高，抗體的出現也較為遲緩，發病第3周后體內才清除病毒；(4)重癥患者(g)和輕癥患者(m)體內抗體水平上升較為緩慢，而體內的病毒載量在發病1周內就已經下降或消失。總體而言，重癥患者和輕癥患者的病毒載量及抗體出現的模式并沒有顯著區別。

圖2 動態檢測7例重癥COVID-19患者(a～g)自發病當天到第50天咽拭子標本中新型冠狀病毒的病毒載量以及針對4種新型冠狀病毒抗原的抗體(IgM和IgG)水平的變化情況

2.4 重癥及輕癥COVID- 19患者病毒載量與血清抗體水平的動態比較

在整個病程中，重癥患者病毒載量比輕癥患者的病毒載量高，特別是在第1周和第3周(P值分別為0.035、0.032)。在抗體方面，重癥患者和輕癥患者血清中刺突蛋白相關的抗原(RBD蛋白、S1蛋白、ECD蛋白)特異性抗體水平相當；另一方面，整個病程中，重癥患者的NP蛋白特異性抗體水平也較輕癥患者高，特別是在第4周(P=0.001 7)和第6周(P=0.03)。見圖4。

圖4 重癥和輕癥新冠肺炎患者病毒載量與血清抗體水平的動態比較

3 討 論

SARS-CoV-2是一種新型β屬冠狀病毒，為一組高度多樣的、包膜的、線性的單股正鏈RNA，屬于已知可感染人類的第7類冠狀病毒[3-4]。冠狀病毒結構形態上類似皇冠而得名，膜表面有4種糖蛋白，即刺突糖蛋白(spike glycoprotein，S蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein，M蛋白)和NP蛋白[5]。RBD蛋白和NP蛋白是SARS-CoV-2抗體檢測的主要抗原位點[6]。目前商業化的試劑盒多采用單一的抗原(NP蛋白或RBD蛋白)，針對多種SARS-CoV-2抗原的特異性抗體的動態監測聯合病毒載量的變化尚未見報道。

圖3 輕癥COVID-19患者從當天到第50天咽拭子標本中新型冠狀病毒載量與針對4種新型冠狀病毒抗原的抗體水平(IgM和IgG)的變化情況

本研究所選取的主要抗原位點也是S蛋白相關的3種抗原(S1、RBD和ECD)和NP蛋白。S蛋白是一種糖蛋白，由1 160～1 400個氨基酸殘基組成，并含有多個N-糖基化位點，是介導冠狀病毒識別、侵染宿主細胞的重要元件[7]。S蛋白通常在病毒組裝過程中被剪切為球狀的S1亞基和棒狀的S2亞基。S1亞基暴露于包膜表面，是識別、結合宿主細胞表面受體的重要部位；S2 亞基嵌于包膜內，是介導病毒包膜與宿主細胞膜融合、實現病毒入侵的關鍵結構[7]。其中S1亞基頭部尖端含有RBD，可以與人類受體—血管緊張素轉化酶2(ACE2)結合[8]。對72份COVID-19患者的血清標本進行分析發現，S1蛋白的抗體相比于針對RBD蛋白的抗體，具有較高的檢出率；由于ECD抗原包括S1亞基和S2亞基，針對ECD抗原的抗體的檢出率略高于RBD蛋白和S1蛋白。因此，考慮利用ECD抗原作為抗體檢測試劑盒的包被抗原，可能提高早期COVID-19患者抗體檢出的敏感度。

作為病毒顆粒的核心成分，NP蛋白在冠狀病毒中含量豐富，不僅參與了病毒基因組的形成，也與冠狀病毒復制周期以及宿主細胞對病毒感染的反應有關[9]。NP蛋白位于病毒的內部，針對NP蛋白的抗體檢出率也略低于針對其他3個蛋白的抗體檢出率，但針對4種不同抗原的抗體檢出率之間差異無統計學意義(P>0.05)。

針對4種不同抗原的特異性抗體，重癥患者中IgM出現最早的是抗RBD-IgM和抗NP-IgM[10]，IgG出現最早的是抗NP-IgG；輕癥患者中，IgM出現最早的是抗RBD-IgM和抗ECD-IgM，IgG都出現在病程的第3周。針對S蛋白的抗體可能是具有保護性功能的中和抗體[11]，而針對NP蛋白的抗體并沒有中和病毒的能力。因此，雖然重癥患者血清中針對SARS-CoV-2的特異性抗體較高，但基本是針對NP蛋白的特異性抗體，可能在COVID-19疾病進展中起到一定作用。

對COVID-19患者整個病程期間的病毒載量和抗體動態變化模式進行分析發現，不同患者的病毒載量和抗體水平差異較大:有的患者血清中特異性抗體水平不斷升高，病毒載量水平也同時呈現明顯下降趨勢甚至檢測不出，可見特異性抗體表現出明顯的保護作用；而有的患者體內抗體水平上升較為緩慢，體內的病毒載量在發病早期(第1周)就已經下降或消失，此類患者是否存在再次感染的風險，有待加大樣本量后的持續研究。

在發病第1周和第3周，重癥患者的SARS-CoV-2載量顯著高于輕癥患者，提示病毒載量可能是COVID-19重癥化的重要因素之一。通過重癥患者與輕癥患者的新冠抗體比較發現，總體上重癥患者血清中NP IgG和S1 IgG抗體水平高于輕癥患者，而輕癥和重癥患者血清中其他檢測的抗體水平相當，這可能由于重癥患者體內的病毒載量過高，導致新冠特異性抗體水平較高。此外，本研究還發現，個別康復期輕癥患者IgM和IgG抗體水平較低，此類患者是否存在再次感染的風險，有待后續的長期觀察。

本研究有一定的局限性，入組患者的數量僅有19例，且本地未出現新冠死亡病例，故入組患者缺乏死亡病例。但針對4種不同抗原檢測其抗體，并結合患者體內病毒載量的動態水平進行分析，這些數據可為SARS-CoV-2的抗體檢測、基于抗體的COVID-19患者治療策略以及疫苗的研發提供參考。