睡眠剝奪介導(dǎo)神經(jīng)元自噬抑制對(duì)小鼠抑郁樣行為和認(rèn)知功能的影響

陳春華，陳繼華，黃瓊，何清，谷娟

(郴州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 郴州 423000)

抑郁癥是以顯著持久的心情低落為特征的精神障礙性疾病，數(shù)百萬抑郁癥患者伴有睡眠障礙問題，且睡眠障礙已被納入抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。雖然有部分研究報(bào)道短期快速異相睡眠剝奪(paradoxical sleep deprivation)會(huì)對(duì)抑郁癥重癥患者具有一定的治療作用[2]，但是長(zhǎng)期持續(xù)的睡眠剝奪可能會(huì)改變紋狀體和海馬體中情緒相關(guān)的單胺能神經(jīng)遞質(zhì)、5-羥色胺代謝物的含量，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)發(fā)生，因此會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)抑郁樣行為[3-4]。此外，睡眠剝奪已被證實(shí)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌不足、神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)，最終誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能障礙[5]。細(xì)胞自噬是由自噬小泡包裹胞內(nèi)受損細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解的過程[6]。自噬是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑，異常的神經(jīng)元自噬已被報(bào)道與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[7]。現(xiàn)階段針對(duì)睡眠剝奪誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)抑郁樣行為與認(rèn)知功能障礙的機(jī)制探討鮮有報(bào)道。因此，本研究擬采用睡眠剝奪模型，探究異相睡眠對(duì)抑郁小鼠腦中海馬神經(jīng)元自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只健康雄性C57/6J小鼠，7周齡，SPF級(jí)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室溫度(23±1) ℃，晝夜節(jié)律12 h/12 h，濕度(60±5)%，所有動(dòng)物自由飲食攝水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、睡眠剝奪組和雷帕霉素組，每組12只。其中雷帕霉素組在小鼠睡眠剝奪造模前1天開始腹腔注射給藥，劑量20 mg·kg-1，每天1次，持續(xù)給藥至睡眠剝奪模型構(gòu)建結(jié)束；其他兩組腹腔注射生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

雷帕霉素 (rapamycin, Rap)購(gòu)于美國(guó)MCE公司；促腎上腺素皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)、皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)等試劑盒購(gòu)于武漢華美生物科技公司；HE染色試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)于上海碧云天生物科技公司；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抗體、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3(autophagy related protein light chain, LC3)抗體、自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer, FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗購(gòu)自于美國(guó)CST公司。

1.3 睡眠剝奪造模

參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行為期7 d的睡眠剝奪造模。對(duì)照組小鼠置于直徑8 cm、高6 cm的柱體平臺(tái)上，平臺(tái)底部無積水。睡眠剝奪組和雷帕霉素組小鼠置于直徑3 cm、高6 cm的柱體平臺(tái)上，將平臺(tái)置于水箱中，注水至平臺(tái)下1 cm，兩組小鼠能夠在各平臺(tái)間自由移動(dòng)、進(jìn)食、飲水。睡眠剝奪組和雷帕霉素組水中平臺(tái)僅能滿足小鼠正常攝水飲食活動(dòng)，當(dāng)小鼠進(jìn)入睡眠且由正相睡眠期過度至異相睡眠期時(shí)，由于全身肌肉松弛，小鼠此時(shí)會(huì)掉入水中并蘇醒。借此方法剝奪小鼠異相睡眠。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮裝置是一個(gè)直徑1.6 m的圓形水池，裝置有4個(gè)象限，分別為目標(biāo)象限、左側(cè)象限、右側(cè)象限和對(duì)側(cè)象限，其中目標(biāo)象限中央放置一個(gè)逃生平臺(tái)，記為逃生象限。訓(xùn)練中將各組小鼠自不同象限投入水中，記錄各小鼠90 s內(nèi)達(dá)到逃生平臺(tái)時(shí)間，記為逃避潛伏期。若90 s內(nèi)未能找到平臺(tái)則引導(dǎo)至平臺(tái)，記錄逃避潛伏期為90 s。所有小鼠共訓(xùn)練4次。次日進(jìn)行水迷宮檢測(cè)，撤去逃生平臺(tái)，將小鼠自對(duì)側(cè)象限放入水中，記錄各組小鼠逃避潛伏期，穿越逃生象限次數(shù)及在目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 所有小鼠單籠飼養(yǎng)，禁食禁水12 h后，給予1瓶純凈水和1瓶1%蔗糖水，測(cè)試每只小鼠12 h內(nèi)飲用蔗糖水占所有飲水比例，記為糖水偏好率。糖水偏好率(%)=蔗糖水消耗質(zhì)量(g)/[純凈水消耗質(zhì)量(g)+蔗糖水消耗質(zhì)量(g)]×100%。

1.4.3 懸尾實(shí)驗(yàn) 安靜、避光環(huán)境下，將小鼠尾尖2 cm 粘貼于平臺(tái)上，所有小鼠之間使用障礙物隔離。小鼠適應(yīng)環(huán)境2 min后，應(yīng)用攝像軟件記錄小鼠4 min內(nèi)懸掛不動(dòng)時(shí)間，記為懸尾不動(dòng)時(shí)間。

1.4.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 安靜、避光環(huán)境下，將小鼠獨(dú)自置于注滿水的圓形容器中，小鼠適應(yīng)環(huán)境2 min后，應(yīng)用攝像軟件記錄小鼠4 min內(nèi)在水中的不動(dòng)時(shí)間，記為強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。

1.4.5 開野實(shí)驗(yàn) 安靜、避光環(huán)境下，將小鼠置于40 cm×40 cm的開野箱中，測(cè)試軟件將開野箱均分為16個(gè)正方塊。所有小鼠適應(yīng)2 min后，應(yīng)用軟件記錄小鼠4 min內(nèi)穿越每個(gè)正方塊的次數(shù)，記為穿格次數(shù)得分。

1.5 電子透射顯微鏡觀察

迅速處死小鼠，分離出海馬組織，在CA1區(qū)截取約1 mm3組織，固定于2.5%戊二醛中，4 ℃固定24 h，PBS沖洗組織，應(yīng)用1%鋨酸磷酸鹽緩沖液再次固定2 h。PBS緩沖液沖洗，梯度乙醇脫水10～15 min，再以100%丙酮溶液浸潤(rùn)組織2次(15 min·次-1)，最后使用包埋劑浸透過夜。次日挑出組織放入包埋板中聚合，60 ℃加熱過夜使組織硬化，使用金剛石刃將組織切成60～80 nm超薄切片，最后應(yīng)用飽和醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色。應(yīng)用日立H-7650透射電鏡觀察各組小鼠海馬組織細(xì)胞自噬情況。

1.6 HE染色

迅速處死小鼠，取出腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中。48 h后取出組織，應(yīng)用梯度酒精常規(guī)脫水并包埋，將切片切成5 μm厚，脫蠟至水。切片首先置于蘇木精染色液中染色3 min，再放入0.5%鹽酸酒精中分化10 s，隨后置入氨水返藍(lán)液中3～5 min，最后放入1%伊紅溶液中30 s～1 min。結(jié)束后使用去離子水沖洗染色液，再以梯度酒精迅速脫水，二甲苯透明1 min，中性樹膠封片，使用光學(xué)顯微鏡拍攝圖片。

1.7 免疫熒光檢測(cè)

迅速處死小鼠，取出腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中。48 h后取出組織，應(yīng)用梯度酒精脫水。將腦組織快速冷凍，在-20 ℃條件下，沿其冠狀面切成5 μm厚切片，固定于載玻片上。室溫下，將腦組織玻片置于10%BSA溶液中封閉2 h，PBST沖洗切片，每個(gè)切片組織上添加200 μl mTOR單克隆抗體稀釋液，4 ℃ 條件下濕盒中避光孵育12 h。次日，將切片與FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗一起孵育，最后將切片用DAPI染色15 min，加入抗熒光猝滅劑封片，使用熒光顯微鏡觀察并拍攝。

1.8 試劑盒檢測(cè)

所有小鼠眼眶取血500 μl，以3 000 r·min-1離心后取血清備用。根據(jù)試劑盒說明書的步驟加入血清樣品、試劑盒試劑，按說明書孵育抗體，棄去試劑。在說明書要求波長(zhǎng)處使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算小鼠血液各項(xiàng)指標(biāo)含量。

1.9 Western blotting檢測(cè)

迅速處死小鼠，取海馬組織，按體積質(zhì)量比4∶1加入含RIPA裂解液，4 ℃條件下勻漿10 min，待形成組織細(xì)胞懸液后靜置30 min，讓組織細(xì)胞充分裂解，以12 000 r·min-1離心20 min，加入Loading Buff密封后沸水浴20 min使蛋白變性。配置4%濃縮膠與10%分離膠，等量上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜置于脫脂牛奶中封閉2 h，4 ℃條件下孵育一抗稀釋液過夜。次日洗凈一抗稀釋液，室溫下孵育二抗稀釋液2 h，洗凈二抗稀釋液后在條帶上均勻地涂上發(fā)光液，自動(dòng)成像儀成像并分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 睡眠剝奪造成小鼠出現(xiàn)顯著的抑郁樣行為

長(zhǎng)期睡眠剝奪顯著降低了小鼠糖水?dāng)z取率與開野實(shí)驗(yàn)中穿格次數(shù)得分(P<0.05)，但卻顯著延長(zhǎng)強(qiáng)迫游泳與懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)。與此同時(shí)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素卻顯著改善了小鼠糖水?dāng)z取率(P<0.05)，提高了小鼠開野實(shí)驗(yàn)中穿格次數(shù)(P<0.05)，且有效減少了強(qiáng)迫游泳與懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 睡眠剝奪造成小鼠出現(xiàn)顯著的認(rèn)知功能障礙

長(zhǎng)期睡眠剝奪造成小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，在目標(biāo)象限中停留時(shí)間顯著減少(P<0.05)，且穿越平臺(tái)象限次數(shù)顯著減少(P<0.05)。然而，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)則有效減少小鼠逃避潛伏期(P<0.05)，增加小鼠在目標(biāo)象限中停留時(shí)間與穿越平臺(tái)象限次數(shù)(P<0.05)。見表2、3。

表2 3組小鼠不同訓(xùn)練次數(shù)后的逃避潛伏期比較

表3 3組小鼠測(cè)試期間的各項(xiàng)認(rèn)知功能指標(biāo)比較

2.3 睡眠剝奪造成小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)相關(guān)激素分泌增加

長(zhǎng)期睡眠剝奪造成血清中HPA軸功能亢進(jìn)標(biāo)志物CRH、ACTH、CORT激素水平顯著上調(diào)(P<0.05)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素給藥可有效降低小鼠血清中CRH、ACTH、CORT水平(P<0.05)，見表4。

表4 3組小鼠HPA軸的相關(guān)激素水平比較

2.4 睡眠剝奪造成小鼠海馬組自噬水平抑制

電子顯微鏡檢測(cè)自噬囊泡是鑒定自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。通過電子顯微鏡評(píng)估海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元中自噬囊泡的形成,結(jié)果顯示:對(duì)照組神經(jīng)元相對(duì)正常，具有相對(duì)健康的細(xì)胞核和完整的線粒體膜，自噬囊泡較多；睡眠剝奪組小鼠海馬組織中線粒體體積腫脹，線粒體膜界限模糊，視野中自噬囊泡減少；雷帕霉素組神經(jīng)元中線粒體恢復(fù)正常，且視野中自噬囊泡增加。見圖1。

圖1 3組小鼠電鏡觀察下海馬組織中線粒體形態(tài)與自噬囊泡數(shù)量

2.5 睡眠剝奪造成小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷

睡眠剝奪造成小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，自噬抑制劑雷帕霉素干預(yù)可顯著恢復(fù)小鼠海馬組織中神經(jīng)元狀態(tài)，見圖2。

圖2 3組小鼠HE染色后海馬組織中神經(jīng)元狀態(tài)

2.6 睡眠剝奪造成小鼠海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)抑制

睡眠剝奪造成小鼠海馬組織中自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)可顯著增加了海馬組織中LC3及Beclin-1的表達(dá)(P<0.05),見表5、圖3。

圖3 3組小鼠海馬組織中LC3、Beclin-1的表達(dá)

表5 3組小鼠自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1表達(dá)情況比較

2.7 睡眠剝奪造成小鼠海馬中mTOR表達(dá)增加，而自噬相關(guān)蛋白減少

睡眠剝奪造成小鼠海馬組織中mTOR表達(dá)增加(P<0.05)，LC3-II/LC3-I和Beclin-1表達(dá)卻顯著降低(P<0.05)。雷帕霉素給藥后小鼠海馬組織中mTOR表達(dá)出現(xiàn)顯著抑制(P<0.05)，而LC3-II/LC3-I和Beclin-1表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖4、表6。

表6 3組小鼠mTOR、LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平比較

圖4 Western blotting檢測(cè)3組小鼠海馬組織中蛋白表達(dá)情況

3 討 論

臨床常見精神障礙性疾病如抑郁癥、躁郁癥等已被證明與晝夜生活節(jié)律破壞密切相關(guān)[9]。正常、規(guī)律且充足的睡眠是幫助機(jī)體恢復(fù)身體機(jī)能的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)。迄今為止，睡眠/覺醒周期被破壞是最廣泛報(bào)道的與抑郁癥發(fā)病相關(guān)的晝夜生活節(jié)律紊亂情況[10]。整個(gè)睡眠/覺醒周期主要分為正相睡眠期與異相睡眠期。正相睡眠期是指機(jī)體由清醒逐漸進(jìn)入睡眠狀態(tài)，此時(shí)全身肌肉松弛但仍有一定的緊張度。當(dāng)機(jī)體進(jìn)入異相睡眠期，機(jī)體各種感覺會(huì)進(jìn)一步退步，肌肉更加松弛，肌腱反射消失。利用這一生理特性，本研究將小鼠置于僅能滿足緊張性肌肉行動(dòng)的平臺(tái)上，當(dāng)小鼠進(jìn)入異相睡眠狀態(tài)，由于肌肉松弛會(huì)跌入水中從而恢復(fù)清醒狀態(tài)。借此方法介導(dǎo)小鼠異相睡眠期的剝奪，從而模擬臨床睡眠質(zhì)量差造成患者出現(xiàn)抑郁樣癥狀。這一造模過程持續(xù)7 d。

現(xiàn)階段，睡眠剝奪對(duì)抑郁癥患者是正向改善還是負(fù)向加劇仍存在一定的爭(zhēng)議[11]。本研究顯示7 d的睡眠剝奪可誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為。遭受睡眠剝奪小鼠表現(xiàn)出無喜感偏好，即糖水偏好實(shí)驗(yàn)中糖水?dāng)z取率顯著降低的現(xiàn)象。與此一致，遭受睡眠剝奪小鼠表現(xiàn)出沮喪的行為，即強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)與懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，開野實(shí)驗(yàn)中穿格評(píng)分顯著降低。與此同時(shí)，遭受睡眠剝奪小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙的行為，即Morris水迷宮中小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，而穿越平臺(tái)象限次數(shù)顯著減少，且目標(biāo)象限停留時(shí)間減少。此外，小鼠分泌系統(tǒng)也出現(xiàn)了顯著的失衡，表現(xiàn)為CRH、ACTH、CORT等激素分泌增加，即HPA軸功能過度活化。HPA軸亢進(jìn)會(huì)影響單胺遞質(zhì)的傳遞，造成抑郁癥的發(fā)展。HPA軸亢進(jìn)會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)谷氨酸(Glu)釋放和興奮性傳遞異常增強(qiáng)，導(dǎo)致Glu/γ-氨基丁酸(GABA)比例增大，GABA相關(guān)信號(hào)被抑制，引起神經(jīng)毒性，促進(jìn)抑郁癥的進(jìn)展[12]。本研究睡眠剝奪成功造成了小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，并導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙。值得關(guān)注的是，本研究持續(xù)腹腔注射自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素的小鼠，其抑郁樣行為各項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)顯著改善，認(rèn)知功能相關(guān)指標(biāo)顯著提升。此外，HPA軸亢進(jìn)相關(guān)激素分泌回歸基線。因此，自噬在睡眠剝奪誘導(dǎo)的抑郁樣癥狀和認(rèn)知功能障礙中扮演著重要角色，雷帕霉素作為一種自噬誘導(dǎo)劑，能夠有效改善睡眠剝奪誘導(dǎo)的抑郁樣癥狀和認(rèn)知功能障礙。

自噬是機(jī)體依賴于溶酶體進(jìn)行的蛋白質(zhì)自我降解過程，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑。正常水平的自噬有利于神經(jīng)元存活，且對(duì)于穩(wěn)定和保障細(xì)胞內(nèi)各種生命活動(dòng)正常有序進(jìn)行至關(guān)重要[13]。自噬功能失調(diào)導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器的堆積，介導(dǎo)神經(jīng)元功能失調(diào)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。然而，自噬功能亢進(jìn)，就會(huì)降解過多的健康細(xì)胞器或自身蛋白，超過自身代償范圍從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。現(xiàn)階段，自噬對(duì)抑郁癥的調(diào)節(jié)作用是正向調(diào)節(jié)還是負(fù)向調(diào)節(jié)仍存在很多爭(zhēng)議[14]。Kara等[15]研究顯示，海藻糖具有增強(qiáng)自噬的作用，具體表現(xiàn)為降低前額葉皮質(zhì)中p62/Beclin-1之值，連續(xù)3周的飲用后小鼠抑郁樣行為得到顯著改善。然而，快速抗抑郁樣藥物氯胺酮能夠快速激活mTOR通路，但mTOR通路的長(zhǎng)期激活卻能夠抑制自噬反應(yīng)[16]。

本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期睡眠剝奪誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元自噬抑制，導(dǎo)致受損的細(xì)胞器堆積，造成海馬神經(jīng)元凋亡。

mTOR負(fù)反饋調(diào)控著機(jī)體的自噬水平，其機(jī)制為mTOR活化能夠抑制自噬起始蛋白UNC-51激酶1(unc-51-like kinase 1, ULK1)的表達(dá)，抑制多種自噬相關(guān)蛋白于自噬前體結(jié)構(gòu)的定位，減少自噬反應(yīng)的發(fā)生[17]。本研究雷帕霉素成功抑制了睡眠剝奪誘導(dǎo)的海馬組織中mTOR活化，誘導(dǎo)自噬反應(yīng)的發(fā)生。LC3是自噬過程中重要蛋白，它直接與P62結(jié)合并通過自噬溶酶體途徑降解。LC3以兩種形式存在，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ?yàn)槌墒熳允尚◇w的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。當(dāng)細(xì)胞自噬反應(yīng)發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ經(jīng)酯化轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ與自噬體膜上磷脂酰乙醇胺結(jié)合并始終定位在胞內(nèi)自噬體膜上。因此，LC3-Ⅱ含量與自噬泡的量呈正相關(guān)[18]。本研究睡眠剝奪誘導(dǎo)小鼠海馬組織中LC3-Ⅱ表達(dá)顯著降低，而雷帕霉素給藥則顯著上調(diào)海馬組織中LC3-Ⅱ表達(dá)水平，增加海馬組織中自噬，提高細(xì)胞存活率。Beclin-1對(duì)自噬體膜的聚集至關(guān)重要，可促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)自噬[19]。近期研究結(jié)果顯示，Beclin-1敲低小鼠海馬組織中神經(jīng)元自噬水平下降，在阿爾茲海默病模型大鼠腦中易引起淀粉樣前體蛋白(APP)與淀粉樣Aβ蛋白聚集，大鼠癡呆樣癥狀加深且炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[20]。然而，在外源性注射Beclin-1蛋白后，大鼠腦中淀粉樣蛋白沉淀減少。由此提示，Beclin-1水平升高能夠促進(jìn)神經(jīng)元自噬的增加，提高淀粉樣蛋白的清除。本研究自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素升高了Beclin-1蛋白表達(dá)水平，提示雷帕霉素給藥逆轉(zhuǎn)了睡眠剝奪介導(dǎo)的自噬抑制，改善神經(jīng)元狀態(tài)。

綜上所述，睡眠剝奪介導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬水平抑制，造成海馬神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣癥狀，并最終誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能損傷；而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素能夠通過抑制mTOR蛋白表達(dá)，上調(diào)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自噬水平，減少睡眠剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷，最終改善小鼠認(rèn)知功能。