黃芩苷調節PI3K/AKT通路對LPS誘導大鼠流產子宮巨噬細胞的影響

魯小紅

(咸寧市中心醫院 產科，湖北 咸寧 437100)

流產發生率為1%～3%，給孕婦和家庭帶來極大的痛苦。大量研究顯示免疫細胞異常浸潤與流產有關聯[1]。巨噬細胞占植入部位所有蛻膜組織中白細胞的20%～25%[2]。巨噬細胞可能會極化為M1或者M2亞型，子宮蛻膜組織巨噬細胞在正常妊娠中會極化為M2亞型，而在妊娠并發癥如子癇等中，子宮蛻膜組織巨噬細胞則極化為M1亞型，這會介導炎癥反應并誘導滋養層細胞凋亡，進而誘發流產[3]。PI3K/AKT在調控巨噬細胞的活化和極化中具有關鍵作用，地塞米松通過激活PI3K/AKT通路抑制巨噬細胞向M1極化，從而抑制炎癥反應緩解肺缺血/再灌注損傷[4]。黃芩苷為一種多酚類物質，是黃芩的主要活性單體。黃芩苷具有抗腫瘤、抗氧化應激、抗炎和調控免疫的作用。黃芩苷可通過促進巨噬細胞極化為M2表型改善實驗性炎癥性腸病[5],抑制滋養層細胞凋亡從而緩解子癇[6]，并且具有調控PI3K/AKT通路的作用[7]，但是其在流產中的作用和機制仍不清楚。本研究主要分析黃芩苷調節PI3K/AKT通路對流產動物模型巨噬細胞的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

SD大鼠(SPF級，雌性+雄性，210～240 g，北京維通利華動物公司)。脂多糖(lipopolysaccharid，LPS)和黃芩苷(Sigma公司，美國)，PI3K/AKT通路抑制劑LY294002(Selleck公司，美國)，ELISA試劑盒和TUNEL染色試劑盒(碧云天公司)，酶標儀(Model 680，Bio-Rad公司，美國)，免疫磁珠(Invitrogen公司，美國)，流式細胞儀以及巨噬細胞表型抗體試劑(Becton Dickinson公司，美國)，TRIzol(Sigma公司，美國)，PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司，日本)，RIPA裂解緩沖液(Beyotime公司)，BCA試劑盒(武漢博斯特生物技術有限公司)，抗體購自美國Abcam公司，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 大鼠的建模、分組和干預

將雌雄SD大鼠以2∶1的比例交配過夜，通過檢查陰道精子的存在確認成功懷孕。將60只成功懷孕大鼠分為4組，即對照組、LPS組、LPS+黃芩苷組和LPS+黃芩苷+LY294002組(n=15)。在妊娠后第5天通過尾靜脈注射LPS，劑量為1.0 μg·kg-1[8]；尾靜脈注射黃芩苷[9]，劑量為5 mg·kg-1，每日1次，至妊娠第10天；腹腔注射LY294002(1 mg·kg-1)來抑制PI3K/AKT通路，每2天1次，至妊娠第10天。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 胚胎發育情況 在大鼠妊娠第10天進行安樂死，取出子宮組織，觀察胚胎發育情況，計算流產率(流產胚胎數量/胚胎總數×100%)和胚胎吸收率(吸收胚胎數量/胚胎總數×100%)。其中出現1例胚胎吸收即將大鼠列為胚胎吸收。

1.3.2 ELISA檢測炎癥因子 取大鼠尾靜脈血，以300 r·min-1離心15 min，收集上清液，根據試劑盒說明書加入抗體和顯色劑，終止顯色反應后15 min 內通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度，然后根據標準曲線計算腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的質量濃度。

1.3.3 流式細胞術檢測巨噬細胞 利用免疫磁珠收集來自子宮組織的單核細胞，并使用染色緩沖液(BD Biosciences公司，美國)洗滌。分別使用藻藍蛋白(APC)偶聯的CD11c抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯的F4/80抗體對細胞在避光下進行染色，染色溫度為0℃，染色時間為30 min。使用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，并使用FLOWJO軟件分析巨噬細胞 比例(CD206和F4/80染色陽性的細胞為巨噬細胞)。

1.3.4 免疫組化檢測巨噬細胞極化情況 通過免疫組化檢測子宮蛻膜組織中M1巨噬細胞標志蛋白CD86和巨噬細胞標志蛋白CD206的表達水平。將大鼠巨噬細胞用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標本，將切片在-20 ℃的冷丙酮中固定15 min。在37 ℃下 分別與抗大鼠CD86和CD206抗體孵育1 h，然后加入二抗進行顯色，最后利用蘇木精復染細胞核，棕色和黃色染色代表陽性細胞。隨機選擇5個高倍視野，計算M1細胞和M2細胞比例(CD86或CD206陽性細胞數目/總細胞數目×100%)。

1.3.5 RT-qPCR檢測mRNA 按照“1.3.3”的方法利用免疫磁珠收集來自子宮組織的巨噬細胞，使用TRIzol獲得總RNA，使用逆轉錄cDNA試劑盒逆轉錄1 μg RNA 用于合成cDNA(42℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。 使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測系統進行qPCR實驗(95 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 60 ℃ 1 min，共40個循環;4 ℃ 保存)。使用GAPDH作為內參，通過比較循環閾值分析mRNA的水平表達。

1.3.6 Western blotting檢測蛋白 將子宮中巨噬細胞研磨萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測量濃度。取40 μg 的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(PAGE，80～120 V，90 min)。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的anti-PI3K、anti-p-PI3K、anti-AKT、anti-p-AKT添加到分離的蛋白質中，并在4 ℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加HRP標志的二抗孵育1 h。然后加入化學發光試劑進行顯影。GAPDH用作內參。用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。

1.4 統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料采用卡方檢驗；計量資料以均值±標準差表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 黃芩苷對胚胎發育情況的影響

對照組大鼠僅有1例胚胎吸收。LPS組全部胚胎吸收和流產。LPS+黃芩苷組胚胎吸收6例，流產5例，均顯著少于LPS組(均P<0.05)；LPS+黃芩苷+LY294002組胚胎吸收14例，流產13例，均顯著多于LPS+黃芩苷組(均P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷對胚胎發育情況的影響 例

2.2 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠炎癥因子的影響

4組外周血炎癥因子水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。LPS組TNF-α和IL-1β的水平顯著高于對照組(均P<0.05)，LPS+黃芩苷組TNF-α和IL-1β的水平顯著低于LPS組(均P<0.05)，LPS+黃芩苷+LY294002組TNF-α和IL-1β的水平顯著高于LPS+黃芩苷組(均P<0.05)。見表2。

表2 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠炎癥因子的影響

2.3 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞的影響

4組大鼠子宮巨噬細胞水平比較差異有統計學意義(F=28.712，P<0.001)。LPS組子宮巨噬細胞比例[(11.87±1.34)%]顯著高于對照組[(3.91±0.87)%](P<0.05)，LPS+黃芩苷組子宮巨噬細胞比例[(6.83±1.04)%]顯著低于LPS組(P<0.05), LPS+黃芩苷+LY294002組巨噬細胞比例[(9.92±1.74)%]顯著高于LPS+黃芩苷組(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞的影響

2.4 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮蛻膜組織中巨噬細胞極化的影響

子宮蛻膜組織巨噬細胞中藍色為被染色的細胞核，棕色為被染色的CD86蛋白，代表M1型巨噬細胞(圖2)；藍色為被染色的細胞核，棕色為被染色的CD206蛋白，代表M2型巨噬細胞(圖3)。4組M1型和M2型細胞比例比較差異有統計學意義(均P<0.05)。LPS組M1型細胞比例顯著高于對照組，而M2型細胞比例顯著低于對照組(均P<0.05)；LPS+黃芩苷組M1型細胞比例顯著低于對照組，而M2型細胞比例顯著高于對照組(均P<0.05)；LPS+黃芩苷+LY294002組M1型細胞比例顯著高于LPS+黃芩苷組，而M2型細胞比例顯著低于LPS+黃芩苷組(P<0.05)。見表3。

圖2 免疫組化檢測黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮蛻膜組織中巨噬細胞M1極化標志蛋白CD86的表達水平(×200)

圖3 免疫組化檢測黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮蛻膜組織中巨噬細胞M2極化標志蛋白CD206的表達水平(×200)

表3 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮蛻膜組織中巨噬細胞極化的影響 %

2.5 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞中PI3K、AKT mRNA表達水平的影響

4組子宮巨噬細胞PI3K、AKT mRNA表達水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。LPS組PI3K、AKT mRNA表達水平顯著低于對照組(均P<0.05)，LPS+黃芩苷組PI3K、AKT mRNA表達水平顯著高于LPS組(均P<0.05)。見表4。

表4 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞中PI3K、AKT mRNA表達水平的影響

2.6 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞PI3K、AKT通路中蛋白表達水平的影響

4組子宮巨噬細胞PI3K/AKT通路中蛋白表達水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。LPS組PI3K、AKT蛋白表達水平顯著低于對照組(均P<0.05)，LPS+黃芩苷組PI3K、AKT蛋白表達水平顯著高于LPS組(均P<0.05)，LPS+黃芩苷+LY294002組PI3K、AKT蛋白表達水平顯著低于LPS+黃芩苷組(均P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 Western blotting檢測黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞中PI3K和AKT 蛋白表達水平

表5 黃芩苷對LPS誘導流產模型大鼠子宮巨噬細胞中PI3K、AKT蛋白表達水平的影響

3 討 論

現階段關于流產的具體機制仍不明確。遺傳、子宮異常、內分泌和免疫功能障礙、感染、營養和環境因素、精神因素等均可能導致流產。對于母體來說，胎兒是半同種異體移植組織，懷孕期間免疫系統的調節對于維持母體對胎兒的免疫耐受和防止母體免疫系統攻擊至關重要[10]。流產與炎癥或免疫力之間的關聯已得到廣泛認可，但是目前對于流產尚無有效的干預手段。

黃芩作為一種常見的中草藥，具有抗腫瘤、抗炎和調節免疫的作用，黃芩苷是其主要的活性成分[11-12]。馬雁南等[9]報道，黃芩苷可以抑制子宮局部組織中TNF-α的表達，從而具有促進胚胎發育的作用。焦偉等[13]研究發現，黃芩苷可以緩解復發性流產小鼠的炎癥反應。本研究使用LPS誘導大鼠流產模型，結果顯示黃芩苷具有減少胚胎吸收、減少流產和抑制炎癥反應的作用。此外，本研究結果還顯示黃芩苷可以明顯減少子宮中巨噬細胞的比例。子宮蛻膜組織中的巨噬細胞可發揮將適應性免疫系統和先天免疫系統聯系起來的作用，從而調節微環境的免疫水平，保證妊娠的順利進行[14]。妊娠期間子宮巨噬細胞數量的升高會影響子宮炎癥微環境，是造成流產的因素之一。子宮蛻膜組織中巨噬細胞升高會導致胚胎發育不良[8]，而抑制巨噬細胞會緩解胚胎吸收和流產[15]。本研究結果提示，黃芩苷可能通過調節子宮中巨噬細胞來抑制炎癥反應，從而抑制由LPS誘導的流產。

為進一步分析黃芩苷對巨噬細胞的影響和調控機制，通過免疫組化檢測巨噬細胞M1極化標志蛋白CD86和M2極化標志蛋白CD206的水平，結果顯示LPS會誘導蛻膜組織中M1型巨噬細胞的增多和M2型巨噬細胞的降低，而黃芩苷會抑制巨噬細胞M1型極化并誘導M2型極化。巨噬細胞向M1極化會分泌TNF-α和IL-1β等促炎因子，這會直接影響滋養層細胞并導致胚胎吸收[16]。PI3K/AKT通路的激活會引起AKT的磷酸化和核轉位，進而誘導M2型極化，抑制PI3K/AKT通路會抑制M2型極化[17]。本研究結果還顯示，LPS誘導流產模型大鼠巨噬細胞中PI3K、AKT轉錄和翻譯水平降低，而黃芩苷會促進PI3K、AKT mRNA和蛋白的表達，使用PI3K/AKT通路抑制劑可以顯著地阻斷黃芩苷的緩解作用。文學平等[18]研究顯示,黃芩苷具有抑制巨噬細胞向M1極化和抑制炎癥細胞因子表達的作用。Xu等[19]研究發現,黃芩苷可通過抑制巨噬細胞向M1極化和誘導向M2極化緩解炎癥反應，進而減少心肌細胞損傷。黃芩苷可通過激活PI3K/AKT通路誘導eNOS的表達，進而緩解心肌細胞缺血-再灌注損傷[20]。這提示LPS可能通過抑制PI3K/AKT誘導子宮巨噬細胞向M1極化導致流產，而黃芩苷可能通過提高PI3K/AKT轉錄和翻譯的水平使巨噬細胞向M2型極化，從而緩解流產。

綜上所述，黃芩苷可能通過促進PI3K/AKT通路來誘導子宮巨噬細胞向M2型極化和抑制向M1型極化，從而抑制流產，但是關于黃芩苷保護胚胎生長和調控巨噬細胞極化的機制仍須進一步研究。