銅綠假單胞菌對鱟素耐藥前后的差異表達基因及SNP變化研究

洪軍 衛(wèi)夏怡 吉冰潔 葉延欣 程天賜

（河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，平頂山 467036）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）作為一種人畜共患條件性致病菌，通常感染肺部、尿道、燒傷等部位，已成為醫(yī)院和養(yǎng)殖廠等感染的三大致病菌之一。由于對抗生素的多重耐藥性，在臨床抗感染治療中有著特殊重要的地位。該菌極易形成生物膜，單獨使用抗生素的治療效果并不理想。目前對銅綠假單胞菌感染的防治是醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的問題，對其耐藥性產(chǎn)生的研究為預(yù)防和治療由銅綠假單胞菌引起的感染具有重要的指導(dǎo)意義。

鱟素（Tachyplesin I）是1988年由Nakamura等［1］從中國鱟血細胞的酸性提取物中分離出來的一種具有17個氨基酸殘基的典型環(huán)狀β-折疊結(jié)構(gòu)的陽離子抗菌肽。已研究證明鱟素具有廣譜抗菌活性，可開發(fā)成抗菌藥物、抗腫瘤藥物、免疫調(diào)節(jié)劑和飼料添加劑等。2019年12月份國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號公告指出：自2020年元旦起，我國飼料中全面禁止添加抗生素，減少濫用抗生素造成的危害，維護動物源食品安全和公共衛(wèi)生安全。因此尋找一些新型抗菌劑替代抗生素已成為新時代綠色環(huán)保養(yǎng)殖行業(yè)的重中之重。作為抗生素替代品的侯選開發(fā)抗菌肽之一，除了作為抗菌藥物使用外，也可以作為新型功能性添加劑應(yīng)用到飼料中。然而，已有研究報道表明一些細菌（尤其人類病原菌）已對部分抗菌肽產(chǎn)生了耐藥性［2-3］。本課題組在實驗室條件下通過長期連續(xù)增高濃度鱟素誘導(dǎo)后，銅綠假單胞菌CGMCC 1.2620和ATCC 27853菌株均能對鱟素產(chǎn)生不同程度的耐藥性［4-5］，但是銅綠假單胞菌耐藥前后能引起哪些基因的差異表達以及是否引起SNP和sRNA的變化，以及sRNA是否能調(diào)控這些差異表達基因尚不清楚。

隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，細菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究可幫助人們探究細菌耐藥前后發(fā)生差異表達的基因以及篩選出具有調(diào)控作用的非編碼RNA。sRNA（small RNA）是一類廣泛存在于原核生物基因組中能被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA 分子，長度為50-300 nt的核苷酸，位于基因組2%-12%的基因間區(qū)域。有研究表明，細菌為適應(yīng)各種不同的外界環(huán)境，通過較為復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來對其做出反應(yīng)，而其中sRNA發(fā)揮了重要的作用［6-7］，并揭示sRNA與細菌耐藥性密切相關(guān)［8］。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段篩選細菌中存在的sRNA并研究sRNA所發(fā)揮的功能，對揭示細菌耐藥基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具有重要意義。Miller等［9］表明銅綠假單胞菌中存在著一系列sRNA，其中Rsm W的過度表達及Rsm Z的表達水平降低均有助于增強生物膜的形成，而Rsm Z的過度表達則會抑制生物膜的形成。劉翠翠［10］利用RNA-Seq技術(shù)對福氏志賀菌的耐藥株中差異表達的sRNA進行了GO富集分析和KEGG Pathway分析，為揭示福氏志賀菌sRNA與其耐藥性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。Zhang等［11］表明在環(huán)境適應(yīng)過程中，細菌利用sRNAs來抑制或激活其蛋白質(zhì)組的大部分表達，并且已經(jīng)鑒定出了兩個sRNAs（Sr0161和ErsA）主要是與負責(zé)碳青霉烯類抗生素攝取的主要孔蛋白OprD mRNA相互作用。這兩個sRNAs與oprD的5'UTR堿基配對導(dǎo)致細菌對美羅培南的耐藥性增加。Sr0161在沒有Hfq的情況下，正調(diào)控PagL的表達，降低其促炎特性并導(dǎo)致多粘菌素抗性。通過RNASeq技術(shù)等轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段可篩選出對細菌外排泵系統(tǒng)、生物被膜形成等具有調(diào)控作用的sRNA及靶基因，從RNA水平揭示了sRNA對細菌耐藥性形成的影響。

SNP（single nucleotide polymorphism）主要是指基因組在核苷酸水平上發(fā)生變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個堿基轉(zhuǎn)換、顛換以及單個堿基插入和缺失等。在基因組DNA中，任何堿基都可能發(fā)生突變，因此SNP可存在于基因的任意序列中，可能位于非編碼序列中，也可能位于基因序列中。張棟等［12］采用直接測序法從P0代尼羅羅非魚的β2m基因組序列中篩選出30個SNP，獲取其位置信息，并利用Popgen32和picc -calc軟件分析其遺傳參數(shù)，結(jié)果表明24個SNPs的基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌的耐感/易感態(tài)顯著相關(guān)。

本研究通過對銅綠假單胞菌野生株CGMCC1.2620（PA1.2620）和 高 抗 鱟 素 突 變 株CGMCC1.2620-99（PA-99）進行轉(zhuǎn)錄組測序，在轉(zhuǎn)錄組水平上通過對差異表達基因以及差異表達的sRNA的靶基因進行功能富集和SNP分析，找到與抗藥相關(guān)的差異表達的sRNA基因及其相關(guān)通路信息以及SNP變化，為進一步探討銅綠假單胞菌對鱟素的耐藥性機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株：銅綠假單胞菌CGMCC1.2620（PA1.2620）由中國微生物菌種保藏中心（CGMCC）提供。耐鱟素突變株銅綠假單胞菌PA-99是由PA1.2620菌株在本實驗室長期連續(xù)暴露的增高鱟素濃度選擇壓力下轉(zhuǎn)接99代獲得的突變株。鱟素對PA1.2620和PA-99菌株的最小抑制濃度值分別為10 μg/mL和150 μg/mL。

抗菌肽：鱟素（tachyplesin I，含有兩個二硫鍵的環(huán)行肽）由吉爾生化（上海）有限公司合成，純度為95%以上。

1.2 方法

1.2.1 測序樣品制備及轉(zhuǎn)錄組測序 PA1.2620原始菌株和PA-99突變株在30℃恒溫搖床上180 r/min培養(yǎng)12 h后，按OD600=0.2的濃度轉(zhuǎn)接到新鮮的MHB培養(yǎng)基中，并生長至OD600=1.0時開始收集。用細菌總RNA純化試劑盒提取和純化總RNA（Sangon Biotech Co.，Ltd.，Shanghai，China）。為 了 確 保總RNA能滿足轉(zhuǎn)錄組測序分析的質(zhì)量，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Agilent 2100、電泳方法檢測RNA樣品的純度、濃度、完整性和是否有基因組DNA污染等。每個樣品3個重復(fù)。總RNA樣本檢測合格后，委托百邁客生物科技有限公司對樣品進行cDNA文庫構(gòu)建和有參轉(zhuǎn)錄組測序分析；測序平臺Illumina HiSeq2500。

1.2.2 基因表達量及差異表達基因功能分析 利用DESeq軟件進行差異表達分析，基因表達量的計算使用RPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）法。將Fold Change≥2且FDR＜0.01作為篩選差異表達基因標準，即log2FC≥1 是上調(diào)表達，log2FC≤1下調(diào)表達［13］。得到差異表達基因后，對差異表達基因進行功能注釋、KEGG Pathway和GO功能分析［14-16］。利用KEGG和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫找出與整個基因組背景相比在顯著差異表達基因中q-Value≤0.05的顯著性富集的Pathway及GO條目。

1.2.3 RT-qPCR驗證 用RT-qPCR來驗證轉(zhuǎn)錄組測序檢測結(jié)果的準確性。分別從PA-99突變株和原始菌株P(guān)A1.2620中選擇5個靶基因進行RT-qPCR分析。每個基因設(shè)3個重復(fù)。此外，使用KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒在ABI7900實時熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR測定。利用Primer Premier 5軟件根據(jù)銅綠假單胞菌基因組序列設(shè)計特異性引物。反應(yīng)條件：95℃ 2 min，94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。以16S rRNA為內(nèi)參，基因的相對表達水平用2-ΔΔCt方法定量［17］。

1.2.4 差異表達sRNA及靶基因的分析 利用miRDeep2 軟件將測序Read比對到基因組上后，看那段區(qū)域是否能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且Read位于臂上，得到一個分值，篩選后得到預(yù)測結(jié)果，用的軟件是miRDeep2。篩選出PA1.2620與PA-99差異表達的sRNA；對篩選出來的差異sRNA靶基因數(shù)據(jù)進行處理，找出差異表達的基因，并對其進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.5 差異表達基因和sRNA靶基因的SNP分析 基于各樣品Reads與參考基因組序列的Bowtie比對結(jié)果，使用GATK軟件識別測序樣品與參考基因組間的單堿基錯配，查找基因區(qū)潛在的單核苷酸多態(tài)性SNP位點。

在有參轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果上進行比對，對實驗中所用對照組與處理組的各個樣品組內(nèi)發(fā)生的SNP進行比對統(tǒng)計，并對其類型和數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果進行分析。通過百邁客云平臺的基于基因ID過濾GFF信息小工具，在銅綠假單胞菌的gff文件中提取得到基因?qū)?yīng)的位置信息。將SNP的位置信息與基因?qū)?yīng)的位置信息比對，可以得到差異基因中產(chǎn)生SNP的數(shù)目和類型。所得數(shù)據(jù)主要通過百邁客云平臺分析。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)及表達量分析

對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾和質(zhì)量控制，之后對兩個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行評估，包括與參考基因組的比對（比對效率都在87.65%及以上）、rRNA統(tǒng)計、測序隨機性評價以及Reads在參考基因組上的分布等，這些分析結(jié)果表明該測序結(jié)果較為理想。在銅綠假單胞菌6 318個基因中，PA-99與PA1.2620菌株的表達差異的基因有1 459個，其中上調(diào)表達的基因為672個，下調(diào)表達的基因為787個。其中l(wèi)og2FC值上調(diào)表達倍數(shù)為3.0以上有35個基因，下調(diào)表達倍數(shù)為3.0以上基因有58個，且下調(diào)倍數(shù)log2FC大于11為28個基因。此結(jié)果表明，銅綠假單胞菌對鱟素產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致許多基因發(fā)生差異表達。

2.2 PA1.2620與PA-99菌株差異表達基因的功能富集分析

2.2.1 差異表達基因的GO功能富集分析 由GO富集的前20個GO條目圖1可知，在分子功能方面發(fā)生富集的亞類主要有：核苷酸結(jié)合（nucleotide binding，18）、甲酸脫氫酶（NAD+）活性（formate dehydrogenase（NAD+）activity，6）、錯 配DNA結(jié)合（mismatched DNA binding，4）、受體結(jié)合（receptor binding，3）等等；在生物過程發(fā)生主要富集的GO條目有：細胞呼吸（cellular respiration，4）、錯配修 復(fù)（mismatch repair，4）、細 胞 溶 解（cytolysis，4）等；在細胞組分主要發(fā)生富集的GO 條目是細胞膜的組成部分（integral component of membrane，158）。最為富集的前3條GO Term依次為：integral component of membrane、nucleotide binding、formate dehydrogenase（NAD+）activity。在GO功能研究中，我們重點關(guān)注GO富集的前20個GO條目。

圖 1 PA1.2620 與 PA-99 菌株差異基因的 GO 富集圖Fig. 1 GO enrichment analysis of differentially expressed genes between PA1.2620 vs. PA-99 strains.

2.2.2 KEGG通路富集分析 根據(jù)PA1.2620與PA-99菌株差異表達基因的KEGG結(jié)果可知，此次分析將395個基因注釋到KEGG的98條通路上，涉及到各種氨基酸、脂質(zhì)、能量、糖類等代謝（266個基因，最多）、ABC轉(zhuǎn)運（36個基因）、雙組分系統(tǒng)（43個基因）、細菌分泌系統(tǒng)（16個基因）、細菌趨化性（16個基因）、氨酰生物合成（14個基因）等通路。由圖2富集的前20個通路可知，無顯著富集的通路。其中細菌趨化性（bacterial chemotaxis）、氨酰生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）通路中所涉及的基因通常與抗藥性密切相關(guān)。但Toluene degradation、Chlorocycchexane and chiorobenzene degradgfion、Phosphonate and phosphinate melaboisn、Novobiocin biosynthesis、Aminobenzoate degradation這些通路需要我們重點關(guān)注。

圖2 PA1.2620與PA-99菌株差異基因的KEGG富集圖Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes between PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.3 RT-qPCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序及后續(xù)SNP和sRNA靶基因等分析的結(jié)果，根據(jù)文獻報道挑選了疑似耐藥性的ParR、phoB、PA3573和opr86差異表達基因以及上調(diào)表達量最高的PA0912基因進行RT-qPCR測定。如圖3所示，所有選擇的差異表達基因在RNA-Seq和RT-qPCR結(jié)果之間顯示一致的表達模式，但是整體而言RT-qPCR數(shù)值較RNA-Seq表達量數(shù)值偏高。

圖3 RT-qPCR驗證結(jié)果Fig. 3 RT-qPCR validation results

2.4 SNP分析

2.4.1 SNP突變類型統(tǒng)計 對PA-99突變株各樣品對比PA1.2620樣品篩選出SNP位點數(shù)目、轉(zhuǎn)換類型比例、顛換類型比例以及雜合型SNP位點比例進行統(tǒng)計，如表1所示。以及對比分析得到各個處理樣品組的SNP類型進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計如圖4所示。根據(jù)圖和表可知：相對于對照基因組來講，各個樣品組間發(fā)生的SNP類型頻率相對一致，在其中發(fā)生轉(zhuǎn)換類型的頻率遠高于顛換類型，在轉(zhuǎn)換之中數(shù)量最多的為A/G，其次是C/T。

表1 SNP位點統(tǒng)計表Table 1 Statistical table of SNP sites

圖4 PA-99突變株樣品的SNP突變類型分布圖Fig. 4 Distribution of SNP mutation types in PA-99 mutant samples

2.4.2 差異表達基因上產(chǎn)生的SNP分析 以PA1.2620菌株作為對照組，將PA-99組菌株與其對比結(jié)果匯總在一起查找差異表達基因的SNP。由PA1.2620與PA-99菌株的差異表達基因上產(chǎn)生的SNP可知，在1 459個差異表達基因中，共有SNP發(fā)生的基因數(shù)目為43個（25個上調(diào)和18個下調(diào)基因），其中新基因是10個如Novel_244、Novel_137、Novel_28等，差異表達值最大的基因是未知功能基因（ID為Novel_28基因）。對這些發(fā)生SNP基因過濾掉僅在一個生物學(xué)重復(fù)中發(fā)生的堿基突變，在這43個差異表達基因中SNP為PA-99菌株3個重復(fù)組共同發(fā)生的基因數(shù)目為22個（12個表達上調(diào)和10個表達下調(diào)基因）如表2所示，此結(jié)果也表明不僅不同處理組間存在SNP變化，而且重復(fù)組內(nèi)也存在SNP變化的差別。這22個發(fā)生SNP的基因中包括5個新基因，7個假定蛋白基因，10個已知功能基因，SNP主要發(fā)生在基因表達量log2FC值在1-3倍之間。Novel_745基因的差異表達值最大（上調(diào)表達log2FC=2.58倍以上），是一種未知功能蛋白，但僅發(fā)生了一個堿基突變。這些發(fā)生SNP突變的已知基因，如pagL 基因是脂質(zhì)A脫酰基酶，是參與脂質(zhì)A代謝過程功能，下調(diào)表達log2FC=2.3倍以下；opr86是一個編碼外膜蛋白基因；PmrB雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)激酶，與脂多糖的修飾有關(guān)。

表2 PA1.2620與PA-99菌株差異表達基因的SNP信息Table 2 SNP analysis of differentially expressed genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5 PA1.2620與PA-99菌株差異表達sRNA分析

2.5.1 差異表達sRNA及其靶基因數(shù)目分析 由表3和圖5可知：按照篩選差異表達基因的標準，篩選到PA1.2620與PA-99菌株的差異表達sRNA共有11個，其中1個sRNA上調(diào)表達，10個下調(diào)表達，且均是未知功能sRNA。通過對其靶基因進行篩選，篩選到的靶基因總數(shù)為5 840個，其中差異表達靶基因為1 247個。每個sRNA所對應(yīng)的靶基因個數(shù)差別較大，其中sRNA Novel_583有968個靶基因包括223差異表達靶基因，而Novel_33有25個靶基因，僅存在4個差異表達靶基因。這些結(jié)果表明，sRNA所對應(yīng)的靶基因越多，調(diào)控的基因功能越多，且存在不同sRNA基因調(diào)控同一靶基因的現(xiàn)象。因其存在不同sRNA有相同的靶基因，過濾掉重復(fù)后其靶基因總數(shù)為4 027個，其中差異表達靶基因為863個。隨后重點關(guān)注這些sRNA的差異表達靶基因。

圖5 PA1.2620與PA-99菌株差異表達的sRNA靶基因數(shù)目統(tǒng)計圖Fig.5 Statistical diagram of the number of sRNA target genes of differentially expressed genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

表3 PA1.2620與PA-99菌株差異表達sRNATable 3 sRNA of differentially expressed genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5.2 sRNA差異表達靶基因GO功能富集分析 根據(jù)PA1.2620與PA-99的 差 異 表 達sRNA靶 基 因的GO富集前20個GO Term可知（圖6），在分子功能大類下主要發(fā)生富集的GO Term有：高絲氨酸激酶活性（homoserine kinase activity，3）、5-羧甲基-2-羥基黏液酸δ-異構(gòu)酶活性（5-carboxymethyl-2-hydroxymuconate delta-isomerase activity，3）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding，8）等等；在生物學(xué)過程大類下主要發(fā)生富集的GO Term有：組氨酸生物合成（histidine biosynthetic process，7）、蘇氨酸氨基甲酰胺腺苷生物合成過程（threonylcarbamoyladenosine biosynthetic process，3）、細胞蛋白質(zhì)代謝過程（cellular protein metabolic process，13）等。最富集的前5個GO Term依次為：組氨酸生物合成（histidine biosynthetic process）、高絲氨酸激酶活性（homoserine kinase activity）、5-carboxymethyl-2-hydroxymuconate delta-isomerase activity（3）、threonylcarbamoyladenosine biosynthetic process、transcription factor binding，均為極顯著富集水平。

圖6 PA1.2620與PA-99菌株表達差異sRNA靶基因的GO富集圖Fig.6 GO enrichment of sRNA target genes of DEGs in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5.3 差異sRNA靶基因的KEGG富集分析 通過KEGG富集圖7可知，沒有顯著富集的通路。但是Biosynthesis of unsaturated fatty acids、Phosphotransferase system（PTS）、Degradation of aromatic compounds、Carbon metabolism等通路所涉及的差異表達基因富集較可靠。

圖7 PA1.2620與PA-99菌株表達差異sRNA靶基因的KEGG富集圖Fig.7 KEGG enrichment of differentially expressed sRNA target genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5.4 差異表達sRNA靶基因的SNP分析 對PA1.2620與PA-99菌株的差異表達的11個sRNA發(fā)生的SNP的數(shù)據(jù)為0個。對其差異表達sRNA的863個差異表達靶基因上發(fā)生的SNP的數(shù)據(jù)進行分析，共有22個靶基因發(fā)生SNP變化，其中在PA-99菌株的3個生物學(xué)重復(fù)中兩者或兩者以上共同發(fā)生的有10個靶基因（表4）。sRNA靶基因發(fā)生SNP變化的較少，且多發(fā)生在較低差異表達靶基因，僅有pvdL基因有2個位點突變，其余9個基因均發(fā)生一個位點突變。這些SNP的變化主要涉及的sRNA所作用的靶基因除了3個靶點新基因外，還涉及到編碼外膜蛋白基因opr86；雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)激酶pmrB，該雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控PA3552-PA3559 脂多糖修飾操縱子，該操縱子是陽離子抗菌肽和多粘菌素B陽離子抗菌肽耐藥所必需的；以及編碼肽合成酶基因pvdL，主要參與銅綠假單胞菌鐵載體合成和脂類生物學(xué)合成過程，參與催化活性的分子功能。sRNA如何參與這些靶基因的功能有待進一步研究及驗證。

表4 sRNA相關(guān)靶基因的SNP變化分析Table 4 SNP analysis of sRNA target genes

3 討論

通過對耐藥菌株中差異表達基因的分析，有助于研究者們從眾多差異表達的基因中篩選出與細菌耐藥性密切相關(guān)的基因及其可能參與的代謝途徑，可為揭示細菌耐藥性機制提供新的思路，同時為新型抗耐藥菌藥物的研究奠定理論基礎(chǔ)。sRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的基因表達調(diào)控因子，通過與靶mRNA或靶蛋白配對，從而調(diào)控細胞的生理功能以應(yīng)對各種環(huán)境變化，尤其在細菌耐藥性的產(chǎn)生方面至關(guān)重要。這些差異表達的sRNA主要是通過作用于相應(yīng)的靶mRNA，進而發(fā)揮其調(diào)控作用。在基因組水平上，由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性即稱為SNP，SNP可進行復(fù)雜性狀的關(guān)聯(lián)分析，從而揭示相關(guān)性狀的遺傳機理。基因突變產(chǎn)生的耐藥性是一個長期積累的過程，不同于轉(zhuǎn)錄組，基因組較穩(wěn)定，不易發(fā)生突變，在經(jīng)過特殊的誘導(dǎo)處理后可產(chǎn)生定向的突變以應(yīng)對環(huán)境中的選擇性壓力。這些突變可能是菌株生存環(huán)境變化后為適應(yīng)新環(huán)境做出的一些應(yīng)對調(diào)整，可能與耐藥性、毒力等相關(guān)基因的特異性突變無關(guān)。對于差異表達基因、sRNA所對應(yīng)靶基因與相應(yīng)SNP進行分析，可從轉(zhuǎn)錄組和基因組層面來預(yù)測銅綠假單胞菌對鱟素耐藥性產(chǎn)生的原因，從而對于耐藥性機制的預(yù)測作為相互補充。因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，對差異表達基因的SNP和sRNA的靶基因進行了預(yù)測分析，以期為銅綠假單胞菌對鱟素的耐藥性的產(chǎn)生提供一定的理論支持。

本研究通過對高抗鱟素銅綠假單胞菌PA-99菌株與PA1.2620敏感菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序，在轉(zhuǎn)錄組水平上通過對差異表達基因及sRNA靶基因進行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因大多與氨基酸、糖類等物質(zhì)的代謝通路、DNA轉(zhuǎn)錄、金屬離子的轉(zhuǎn)運以及代謝、細菌趨化性、雙組分調(diào)控系統(tǒng)等通路有關(guān)以及涉及到細胞膜組成部分、核苷酸結(jié)合及酶的活性等功能。對于差異表達基因和sRNA靶基因的SNP變化，主要涉及到編碼脂質(zhì)A脫酰基酶、外膜蛋白、冷休克蛋白、鐵代謝、以及與脂多糖修飾相關(guān)等已知基因和一些編碼的假定蛋白、部分編碼的新基因有關(guān)，這些靶基因的SNP變化是否與抗藥性相關(guān)有待進一步驗證。這些結(jié)果表明sRNA在調(diào)控銅綠假單胞菌對鱟素的抗藥性方面也發(fā)揮了重要作用。

典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)由組氨酸激酶和相關(guān)的應(yīng)答調(diào)控蛋白組成，組氨酸激酶感受外界環(huán)境變化后調(diào)節(jié)應(yīng)答蛋白的磷酸化水平，而后對一系列應(yīng)答基因進行調(diào)控。雙組分調(diào)控系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的致病性、毒力、生物膜形成和耐藥性等方面起著重要作用［18］。PmrA-PmrB雙組分調(diào)控系統(tǒng)在革蘭氏陰性菌對多黏菌素B耐藥過程中起重要作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)耐鱟素銅綠假單胞菌PA-99菌株中雙組分調(diào)控系統(tǒng)有43個差異表達基因，包括一些受調(diào)控的抗性基因，如pmrA-pmrB、反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoP（基因ID：Novel_194）。PhoA編碼的堿性磷酸酶（基因ID：Novel_498，499）和PA-99突變體中的兩個成分反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoB；并預(yù)測到sRNA靶基因中有29個差異表達基因，且僅編碼修飾脂多糖PmrB基因的SNP發(fā)生堿基突變。此結(jié)果表明，雙組分調(diào)控系統(tǒng)在銅綠假單胞菌對鱟素的耐藥中同樣發(fā)揮作用，且sRNA也有可能參與調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)表達。

氨酰-tRNA生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）的功能是將氨基酸與含有相應(yīng)反密碼子的tRNAs精確匹配。除了在蛋白質(zhì)合成和某些細菌革蘭氏陽性菌肽聚糖交聯(lián)或膜磷脂修飾中發(fā)揮重要作用外，氨酰基-tRNA生物合成還直接參與抗生素生物合成和耐藥性［20］。例如，MprF蛋白通過催化細胞內(nèi)膜脂的氨基酰化來調(diào)控細胞壁對陽離子抗菌肽的通透性，從而介導(dǎo)抗菌肽的耐藥性［21］。膜脂的氨酰化通過調(diào)控細胞膜雙分子層的凈負電荷，其方式依賴于氨酰化 tRNA底物。在本研究中，氨酰基-tRNA生物合成通路在高抗鱟素銅綠假單胞菌PA-99菌株中有14個差異表達基因以及預(yù)測的sRNA靶基因中有10個差異表達基因在此通路中，但這些基因無SNP發(fā)生變化。這個結(jié)果表明銅綠假單胞菌對鱟素抗藥性也涉及到此通路。

生物膜形成的耐藥機制在銅綠假單胞菌中起著關(guān)鍵作用。銅綠單胞菌生物膜的形成途徑包括群體感應(yīng)、細菌分泌系統(tǒng)和化學(xué)感覺系統(tǒng)等。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)有許多與生物形成相關(guān)的差異表達基因及部分sRNA靶基因，如鞭毛組裝（ko02040）、細菌分泌系統(tǒng)（ko03070）和細菌趨化（ko02030）通路，這些通路涉及基因之前被認為與生物膜形成途徑有關(guān)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PA-99突變體比原始菌株P(guān)A1.2620更容易形成生物膜，胞外多糖含量也高于原始菌株［5］。已有學(xué)者探討了sRNA在某些細菌的鐵代謝、糖代謝以及氨基酸代謝中所發(fā)揮的調(diào)控作用［22］。針對鐵代謝，許多細菌都會進化出自身特殊的鐵調(diào)控系統(tǒng)來限制鐵的攝取。Fur作為一種較為重要的鐵調(diào)控蛋白參與到sRNA對鐵的調(diào)節(jié)過程中。在本研究中，sRNA的靶基因vreR是與鐵代謝相關(guān)基因，也發(fā)生了SNP堿基突變。葡萄糖、氨基酸等是細菌的能源物質(zhì)，在細菌耐藥過程中也是受到了嚴格的調(diào)控。有研究指出細菌可以通過sRNA調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)，進而調(diào)控毒力產(chǎn)生、抗菌藥物耐藥等過程。但是，相對于大腸桿菌、沙門氏菌等細菌，關(guān)于銅綠假單胞菌的sRNA調(diào)控耐藥機制的相關(guān)報道相對來說較少，這其中的機制尚不清楚。

4 結(jié)論

銅綠假單胞菌對鱟素的耐藥性導(dǎo)致許多基因發(fā)生差異表達，且有些差異表達基因受到sRNA的表達調(diào)控，并有極個別相對低差異表達基因的SNP發(fā)生堿基突變，這些突變基因主要與膜蛋白修飾、鐵代謝和編碼的假定蛋白等有關(guān)。盡管本研究未涉及這些SNP突變基因的功能驗證，但在文獻中已有報道這些已知基因是與抗藥性相關(guān)，且已選擇5個代表性差異表達基因通過熒光定量證實差異表達基因的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序表達量基本一致。