HPLC-MS/MS測定動物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留

◎ 虞長貴

（鄭州中檢科測試技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

目前，利巴韋林和金剛烷胺均為動物源性食品藥物殘留檢測項目要求，同一種樣品中都要進(jìn)行檢測，現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)是獨立進(jìn)行檢測[1-5]。本研究使用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀同時檢測動物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，節(jié)約資源，為動物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留檢測提供一種檢測技術(shù)手段，在實驗室推廣和應(yīng)用方面具有重要意義[1-5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（島津公司LCMS 8050）；氮吹濃縮儀（EVA32）；高速離心機（日立CR21N）；Milli-Q超純水裝置（Milli-Q Integral 5）；PH計；分析天平（0.000 1 g）；電子天平（0.001 g）；振蕩器（TAITECA）；固相萃取裝置（色譜科）；超聲儀；干燥箱。

1.2 材料與試劑

從市場隨機采購動物源性樣品。

甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、甲酸（色譜級）、乙酸銨（色譜級）、三氯乙酸、氨水、酸性磷酸酯酶、混合型離子交換固相萃取小柱（CNWBOND PBA）、超純水、利巴韋林、利巴韋林內(nèi)標(biāo)C5、金剛烷胺、金剛烷胺內(nèi)標(biāo)D6及離子型親水性T3色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3 100×2.1 mm，1.8 μm）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱取5 g（精確到0.01 g）樣品置于50 mL高速離心管，加入15 mL三氯乙酸溶液和2.5 mL乙腈溶液，渦旋混勻，振蕩10 min，超聲5 min，以20 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液至25 mL容量瓶，樣品再加10 mL三氯乙酸溶液，重復(fù)提取，合并提取液至容量瓶，定容至25 mL。

1.3.2 酶解

移取5 mL提取液至50 mL高速離心管，加入1.0 mL乙酸銨溶液，加入100 μL酸性磷酸酯酶，渦旋混勻，37 ℃干燥箱中酶解2 h。取出冷卻至室溫，用氨水調(diào)節(jié)pH至8.5±0.1，渦旋混勻，20 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。

1.3.3 凈化

上清溶液轉(zhuǎn)入經(jīng)活化的PBA固相萃取小柱，依次用5 mL 10%乙腈-乙酸銨緩沖液、2 mL 5%氨水甲醇淋洗，棄去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱5 min，再用4 mL甲酸-水-甲醇溶液（2∶8∶90）洗脫至氮吹管，45 ℃水浴下氮吹至近干，加入1.0 mL乙腈-水（9∶1）溶解氮吹管中殘渣。經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：離子型親水性色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 100×2.1 mm，1.8 μm；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動相A：乙腈；流動相B：5 mmol·L-1乙酸銨水+0.1%甲酸。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式；檢測模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件選擇

常用提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等試劑，擬選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取液。甲醇、丙酮為親水性溶劑，不利于消除基質(zhì)中一些水溶性成分。本方法考察乙腈和乙酸乙酯兩種溶劑對基質(zhì)進(jìn)行提取，提取效果見表1。結(jié)果表明，乙腈對本方法中檢測兩種物質(zhì)有較高的提取效果。考慮到基質(zhì)中含有蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，因此本方法采用三氯乙酸-乙腈對基質(zhì)進(jìn)行提取。

表1 空白基質(zhì)測定結(jié)果表

2.2 酶解試劑選擇

利巴韋林以原藥、利巴韋林單/二/三磷酸酯形式存在，須對以磷酸酯形式存在的利巴韋林進(jìn)行酶解，才能對試樣中利巴韋林總量進(jìn)行測定，采用37 ℃酸性磷酸酯酶對樣品進(jìn)行酶解，對比了非酶解、酶解2 h和18 h后利巴韋林總量的測試結(jié)果。結(jié)果表明，非酶解測得利巴韋林含量只有酶解2 h含量的2%，酶解2 h和酶解18 h后利巴韋林含量偏差在5%以內(nèi)，因此選擇37 ℃酶解2 h條件。

2.3 固相萃取柱選擇

動物源性食品中獸藥殘留采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，考慮固相萃取柱抗干擾、富集目標(biāo)物能力等因素，本方法研究對比了HLB、C18、PBA 3款固相萃取柱，發(fā)現(xiàn)HLB對利巴韋林和金剛烷胺富集重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，C18固相萃取柱對利巴韋林和金剛烷胺富集能力低，平均回收率在20%以下，PBA固相萃取柱對利巴韋林和金剛烷胺兩種化合物選擇富集能力強，平均回收率能達(dá)到85%以上。因此本方法選用PBA固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化。

2.4 流動相選擇

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式對目標(biāo)物利巴韋林和金剛烷胺進(jìn)行檢測，流動相中加入甲酸能夠提高利巴韋林和金剛烷胺信號響應(yīng)強度，加入乙酸銨能夠改變利巴韋林和金剛烷胺峰形，本方法采用5 mmol·L-1乙酸銨水+0.1%甲酸作為流動相，梯度洗脫。液相色譜梯度洗脫條件見表2。

表2 液相色譜梯度洗脫條件表

2.5 內(nèi)標(biāo)定量和外標(biāo)定量比較

采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種方式對樣品進(jìn)行檢測比對，測試結(jié)果見表3，結(jié)果表明采用外標(biāo)法回收率偏低，不滿足檢測要求，本方法采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測。

表3 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量結(jié)果比對表

2.6 質(zhì)譜特征離子選擇

金剛烷胺、利巴韋林及其內(nèi)標(biāo)物在電噴霧電離源模式下采用SCAN全掃描，根據(jù)全掃質(zhì)譜圖中響應(yīng)值高豐度好的離子作為母離子，進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描模式，將其母離子打碎以獲得子離子碎片，選擇響應(yīng)高的碎片離子作為子離子。通過改變錐孔電壓和碰撞能量優(yōu)化儀器最強響應(yīng)。金剛烷胺、利巴韋林以及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜條件見表4。

表4 保留時間、定性定量離子、錐孔電壓、碰撞能量參數(shù)表

2.7 方法回歸方法、線性范圍及檢出限

取濃度為0.5 μg·kg-1、1 μg·kg-1、2 μg·kg-1、5 μg·kg-1、10 μg·kg-1和20 μg·kg-1金剛烷胺、利巴韋林和濃度為5 μg·kg-1內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜進(jìn)行測試，以外標(biāo)物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值作為縱坐標(biāo)（y），外標(biāo)物濃度作為橫坐標(biāo)（x），繪制工作曲線，空白基質(zhì)中添加兩種化合物標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)檢測，以3倍信噪比為檢出限，以10倍信噪比為定量限，回歸方程，線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表5。

表5 金剛烷胺、利巴韋林回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表

在0.5～20 μg·kg-1濃度范圍內(nèi)，外標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值和外標(biāo)物濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，檢出限為1 μg·kg-1，定量限為2 μg·kg-1，滿足分析要求。

2.8 精密度和加標(biāo)回收

空白樣品加標(biāo)，經(jīng)前處理提取、酶解、凈化后進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。利巴韋林、金剛烷胺的回收率為85%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～2.4%，表明該方法具有較好重復(fù)性及準(zhǔn)確性，符合動物源性食品中獸藥殘留分析要求。

表6 加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表

3 結(jié)論

本文研究了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)法同時測定動物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺的分析方法，通過提取、酶解、凈化3個步驟進(jìn)行定量檢測，方法線性范圍、檢出限、定量限、添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足分析要求。方法操作簡單，準(zhǔn)確度和精確度高，縮減了利巴韋林和金剛烷胺檢測時間，提高了效率，可用于動物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺同時檢測，并為其他食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留檢測提供依據(jù)。