HBV相關原發性肝癌患者T淋巴細胞亞群和細胞因子表達水平差異研究

陳錫蓮 楊勇衛 林靜 李彩東 劉友德 鄒志強

1煙臺市奇山（傳染病）醫院科教科，山東 246001；2煙臺市奇山（傳染病）醫院檢驗科，山東 246001；3甘肅省腫瘤醫院醫學情報研究所，蘭州 730050；4蘭州市第二人民醫院肝病研究所 730046；5煙臺市奇山（傳染病）醫院肝病二科，山東 246001

T 淋巴細胞亞群和細胞因子在乙型病毒性肝炎（HBV）的發病中起重要作用［1］。HBV 感染的結局從自限性肝炎、慢性肝纖維化、肝硬化（LC）到肝癌不等。因此，探究慢性HBV 感染患者外周血或者肝源性的T 細胞亞群和相關細胞因子組成，是研究HBV 免疫病理機制的重要方法［2］。T 淋巴細胞在調節機體的免疫應答、維持自身免疫耐受和內環境穩定方面起重要作用［3］。細胞因子以旁分泌和（或）自分泌的方式直接作用于其所生成的微環境［4］。目前國內外研究T 淋巴細胞（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+）和細胞因子［白細胞介素（IL）-6、IL-17、IL-27、腫瘤壞死因子（TNF）-α］的表達水平與原發性肝癌（HCC）發生相關性的報道尚不多見，本研究選取173例慢性HBV 感染者，依據臨床分型分組討論其外周血T 淋巴細胞和細胞因子的表達水平，深入探討原發性肝癌的發病機理，旨在為闡明HBV 感染后慢性化機制提供數據支持和臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康對照組：2017 年9 月至2020 年5 月煙臺市奇山醫院體檢中心健康查體者40 例，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病等，肝功能正常。其中男25例，女15 例，年齡范圍為23～58 歲，年齡（39.15±14.95）歲。2017 年9 月至2020 年5 月在煙臺市奇山醫院住院及肝病專家門診收治的173例HBV 感染者，所有患者排除甲、丙、丁、戊等肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎等疾病，男114 例，女59 例，年齡范圍為11～73 歲，年齡（45.38±12.72）歲；其中原發性肝癌患者22 例（HCC 組），乙肝肝硬化患者41 例（LC 組），慢性乙型肝炎患者51 例（CHB 組），慢性乙型肝炎病毒攜帶者59 例（ASC組）。診斷符合2015 年中華醫學會肝病學會和中華醫學會感染學會聯合制定的《慢性乙型肝炎診治指南》［5］中的診斷標準。

本研究經煙臺市奇山醫院醫學倫理委員會批準（202003號），所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 T 淋巴細胞檢測方法 取5 組研究對象的空腹血清標本2 ml，乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）抗凝，在樣品測定管中加入50 μl抗凝血，然后加入20 μl單抗（CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP/CD4FITC/CD25PE，均 購 自 美 國BD 公司），及其同型對照IgG2bFITC/IgG1PE（購于天津協科生物技術有限公司）振蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入2.0 ml溶血素，振蕩混勻，室溫避光放置15 min。1 500 r/min（離心半徑15 cm），離心5 min，棄上清液。加入2.0 ml 胎牛血清，1 500 r/min（離心半徑15 cm），離心5 min，棄上清液，重復1 次。加入500 μl 胎牛血清，上機（美國Becton-Dickinson公司FACSV Verse 流式細胞分析儀）檢測。全部數據用流式細胞儀和BD FAC Suite 軟件系統進行熒光參數獲取和分析。

1.2.2 細胞因子檢測方法 采用ELISA 法，試劑盒購自上海朗頓生物科技有限公司，嚴格按照說明書要求操作，使用科華ST-360酶標儀檢測。

1.2.3 HBV DNA 檢測方法 無菌采集5 組研究對象的空腹血清標本2.0 ml，注入無菌離心管，室溫保存2 h，1 600 r/min離心5 min（離心半徑15 cm），吸取離心管中血清200 μl，轉入另一無菌1.5 ml 離心管。最后取5 μl 血清，用于DNA 提取。采用美國ABI-7500 熒光定量PCR 分析儀進行基因擴增，試劑購自廣州達安生物科技有限公司。結果判斷：＜102IU/ml 為陰性，102～104IU/ml 為低載量組，105～106IU/ml為中載量組，＞107IU/ml為高載量組。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計分布，計量資料符合正態分布，數據以均數±標準差（±s）表示，組間方差不齊采用Welch 方差分析，兩兩比較采用Games-Howell 檢驗，多組間及進一步兩兩比較采用Kruskal-WallisH檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 秩相關分析法，相關系數用r表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同臨床分型患者T淋巴細胞亞群表達水平 慢性HBV感染者CD3+水平從ASC組到HCC組逐漸降低，其中HCC 組最低，其次為LC 組，與健康對照組相比，P＜0.05；慢性HBV 感染者外周血CD3+CD4+水平均不同程度升高，LC組最高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；LC 組患者外周血CD3+CD8+水平最低，與其他組相比，均P＜0.05。見表1。

表1 HBV感染者與健康對照組的T淋巴細胞亞群占淋巴細胞百分比（%）

2.2 HCC 組T 淋巴細胞亞群水平與HBV DNA 水平的相關性 HBV DNA 水平與CD3+和CD3+CD8+呈負相關（r=-0.232，P＜0.05；r=-0.220，P＜0.05）。

2.3 不同臨床分型HBV 感染者細胞因子表達水平分析 與健康對照組相比，ASC 組、CHB 組、LC 組和HCC 組外周血IL-6、IL-17、IL-27 和TNF-α 水平均顯著升高（均P＜0.01）；其中HCC 組IL-6 水平最低，ASC 組IL-17 水平最低、IL-27 水平最高，與慢性HBV 感染者其他各組相比，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；ASC 組TNF-α 水平最低，與LC組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 HBV感染者及健康對照組的細胞因子水平（ng/L，± s）

表2 HBV感染者及健康對照組的細胞因子水平（ng/L，± s）

注：HBV 為乙型肝炎病毒，HCC 為原發性肝癌，LC 為肝硬化，CHB 為慢性乙型肝炎，ASC 為慢性乙型肝炎病毒攜帶者，IL 為白細胞介素，TNF為腫瘤壞死因子；與健康對照組相比，aP＜0.01，與ASC組相比，bP＜0.01，與CHB組相比，cP＜0.01，與LC組相比，dP＜0.01

TNF-α 85.68±36.16a 107.60±33.64a 81.44±26.64a 65.37±24.89ad 32.57±16.58 3.52＜0.001組別HCC組LC組CHB組ASC組健康對照組H值P值例數22 41 51 59 40 IL-6 52.34±13.16abcd 75.26±10.45a 80.87±10.97a 95.31±12.46a 25.68±5.52 3.46＜0.001 IL-17 16.04±8.65ab 23.26±15.17ab 21.63±6.54ab 8.75±4.34a 4.44±2.34 1.13＜0.001 IL-27 115.07±38.63ab 104.21±31.15ab 116.31±32.53ab 194.35±43.18a 50.10±17.81 1.66＜0.001

2.4 HCC 組細胞因子表達水平與HBV DNA 水平的相關性 HCC 患者外周血IL-27 和TNF-α 水平均與HBV DNA 呈負相關（r=-0.359，P=0.019；r=-0.367，P=0.017；r=-0.348，P=0.024）。

3 討 論

乙型肝炎是一種免疫相關性疾病，機體感染HBV 后，外周血中各淋巴細胞亞群間的平衡被打破［6-8］。有研究表明，慢性HBV 感染者普遍存在T 淋巴細胞衰竭［9］。本研究發現：慢性HBV感染者CD3+水平從ASC組到HCC組逐漸降低，其中HCC 組患者最低，其次為LC 組患者（P＜0.05）；與健康對照組比，慢性HBV 感染者外周血CD3+CD4+水平均升高，LC 組最高（P＞0.05）；LC 組CD3+CD8+水平最低（P＜0.05），提示機體被HBV 持續感染時，T 細胞免疫功能衰退，其中CD8+T 細胞更易衰竭。有研究表明，HBV DNA 載量與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均呈負相關，HBV DNA 的載量與CD8+呈正相關，提示HBV DNA 載量增加可進一步導致乙肝患者細胞免疫功能紊亂加重，可通過抑制HBV 的復制，改善機體細胞免疫功能［10-13］。本研究顯示：HCC 組HBV DNA水平與CD3+和CD3+CD8+呈負相關（P＜0.05）；推測HBV 感染后，體內病毒會不斷復制，外周血T 淋巴細胞亞群平衡被打破，細胞免疫功能下降，使機體無法有效清除HBV，從而導致慢性HBV 感染和病毒的持續存在。此外，還可以通過觀察患者HBV DNA 載量來推測T 細胞亞群的表達水平，從而分析患者的免疫反應，對指導抗病毒藥物的使用起到積極的作用。

IL-6 可能參與了病毒性肝炎的免疫損害［14-15］。本研究結果顯示：與健康對照組相比，HBV 感染者各組外周血IL-6 水平均顯著升高（均P＜0.01），提示IL-6 與乙型肝炎的發病和病情進展密切相關，在LC 組中，作為一種抗炎細胞因子，能平衡促炎細胞因子或早期細胞因子的損傷作用，起到保護作用。Th17在肝臟炎性損傷中發揮的作用鮮有報道，IL-17 是Th17 細胞分泌的重要細胞因子之一，具有促炎癥作用，可誘導基質金屬蛋白酶趨化因子和促炎細胞因子的表達，參與中性粒細胞的增殖成熟和趨化，引起組織細胞浸潤和破壞，對T 細胞的活化亦起協同刺激作用［15］。本研究發現：與健康對照組相比，HBV 感染者各組血清IL-17 水平均顯著升高（均P＜0.01），這與王妍等［16］研究基本一致，提示血清IL-17 隨著乙型肝炎病程的進展其表達也增強。HBV感染后的肝損傷是指機體抗病毒反應引起的肝細胞免疫損傷，以大量炎性細胞浸潤和肝實質細胞變性壞死為特征。研究證實，IL-27 一方面是Th1 類型免疫反應的起始者，另一方面又能削弱免疫/炎性反應［17-18］。本研究發現：與健康對照組相比，HBV 感染者各組外周血IL-27 水平均顯著升高，其中ASC組IL-27水平最高（P＜0.01）；HCC患者外周血IL-27 水平與HBV DNA 呈負相關（P＜0.05）。提示IL-27 參與了肝臟疾病及原發性肝癌的發生、發展過程，在乙肝病毒感染過程中，能減弱炎性反應，減輕乙肝病毒對肝臟器官的損害。TNF-α在肝硬化的發生發展中參與肝臟的損傷與修復循環，肝纖維化程度越明顯，肝組織內TNF-α含量越高［19］。本研究發現：與健康對照組比較，慢性HBV 感染者各組外周血TNF-α水平均顯著升高，其中LC組TNF-α水平最高，ASC 組最低；HCC 患者外周血TNF-α 水平與HBV DNA 載量呈負相關（P＜0.05）；提示慢性HBV 感染者體內存在不同程度的炎性反應，乙肝病毒直接誘發TNF-α增高，TNF-α在末期肝病的發生發展中發揮重要作用。

總之，HBV 感染的消除或持續進展與機體的免疫功能密切相關。免疫細胞和細胞因子的數量減少，不能有效介導免疫應答，清除體內病毒，導致肝細胞不斷受損。本研究仍有許多問題有待進一步研究：（1）HBV 感染過程中T 細胞和細胞因子免疫功能的具體機制；（2）免疫功能的激活是一把雙刃劍，如何把握藥物調節免疫功能的程度？進一步研究可為HBV感染者的發病機制和個體化治療提供新策略。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。