56 ℃加熱30 min滅活病毒對血清酶學項目檢測結果的影響

尹笑笑 李歡 縱如原 劉倩 楊伏猛

江蘇省連云港市第二人民醫院檢驗科 222006

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）通過入侵人體呼吸道，導致患者出現不同程度的呼吸道疾病，其引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease，COVID-19）嚴重危害了人類的身體健康［1-2］。有研究報道：SARS-CoV-2 可通過呼吸道飛沫、密切接觸以及氣溶膠傳播，故在一定程度上給實驗室操作人員造成了潛在暴露的風險［3-5］。但由于該病毒具有不耐熱的生物學特性，可通過56°C 加熱30 min 將其滅活，故為了降低實驗室操作人員在檢測COVID-19 患者的標本時造成感染的風險，急需采取切實可行的預防措施［6-7］。本研究通過模擬SARS-CoV-2 的滅活條件，基于56 °C 加熱30 min 的方式對血清標本采取滅活處理，并比較滅活前、滅活后血清酶學檢測結果是否有差異，旨在為實驗室通過加熱滅活病毒開展血清酶學的檢測提供潛在的理論支撐。

1 資料與方法

1.1 研究對象 采用完全隨機化原則選取2021 年1 月于連云港市第二人民醫院體檢中心體檢者50 例作為研究對象，其中男性28 例、女性22 例，年齡（43.2±9.5）歲。納入標準：⑴年齡分布在20～60 歲之間；⑵血壓、血糖、血脂正常；⑶血清常規生化指標在正常參考區間內；⑷無吸煙、熬夜、酗酒等不良生活習慣；⑸近半年無手術治療史；⑹近1 個月無藥物治療史。排除標準：⑴排除輸血4 項陽性患者（乙肝、艾滋、梅毒、丙肝）；⑵排除肝功能、腎功能、心功能異常者；⑶排除腫瘤、血液病等惡性消耗性疾病；⑷排除感染其他類型病毒的患者。

該研究經連云港市第二人民醫院醫學倫理委員會審核通過（2020X021），且所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集與處理 告知受檢者采血前注意事項：飲食清淡合理，采血前禁食8～12 h。清晨空腹狀態下靜坐數分鐘后采集靜脈血5 ml（黃色含分離膠管），標本靜置15 min 后4 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm。應用配對設計試驗將離心后的血清分為相同的兩組，一組（50 份）作為滅活前樣本，另一組（50 份）放入電熱恒溫箱56 ℃加熱30 min，待冷卻至室溫后，4 h內完成兩組標本血清酶學項目的檢測。

1.3 實驗器材 ⑴儀器：產自美國貝克曼公司的AU5800 全自動生化分析儀；電熱恒溫培養箱HT-400B（金壇區金城春蘭實驗儀器廠）；醫用低速離心機BY-320A（北京白洋醫療器械有限公司）。⑵試劑：美國貝克曼公司的淀粉 酶（amylase，AMY）、丙 氨 酸 氨 基 轉 移 酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenation enzyme，LDH）測定試劑盒，批號分別為AUZ7420、AUZ7654、AUZ6899、AUZ7859、AUZ7945、AUZ7046；北京利德曼生化股份有限公司生產的腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）、α-L-巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）測定試劑盒，批號分別為20061902、19122511；美國貝克曼公司的混合血清質控品，批號為M901102、M901103。樣本上機檢測前，檢測系統均處于就緒狀態，且當日酶學項目室內質控均在控，分析性能滿足要求。

1.4 檢測方法 本研究各項目檢測的方法：⑴AMY 檢測基于PNP-G7 底物法；⑵ALT 檢測基于乳酸脫氫酶法；⑶AST 檢測基于蘋果酸脫氫酶法；⑷ALP 檢測基于速率法；⑸GGT檢測基于速率法；⑹LDH檢測基于乳酸底物法；⑺ADA檢測基于過氧化物酶法；⑻AFU檢測基于速率法。

1.5 統計學處理 應用SPSS 19.0 軟件進行統計學處理。運用Kolmogorov-Smirnov 檢驗進行數據的正態性檢驗。正態分布的計量資料以（±s）表示，采用配對t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較選用Wilcoxon 秩和檢驗；采用Bland-Altman 圖進行一致性分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

1.6 結果評價 評價56 ℃加熱30 min 滅活病毒對酶學項目是否有影響的標準。⑴比較熱滅活前后檢測結果，當P＜0.05 時，差異有統計學意義，認為滅活對相關指標有影響。⑵血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA 采用國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質評提供的允許總誤差（allowable total error，TEa）［8］：滅活前與滅活后檢測結果的最大允許偏差≤1/3TEa，若滅活前后有20%的檢測結果大于最大允許偏差，認為滅活對酶學相關指標有影響；血清AFU的TEa來源于試劑說明書。

2 結 果

2.1 56 ℃加熱30 min 滅活對血清酶學項目指標的影響 本研究顯示：血清AMY 滅活前與滅活后差異無統計學意義（P＞0.05），故56 ℃加熱30 min 的標本處理方式對AMY 的檢測無顯著影響；而血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU滅活前與滅活后差異有統計學意義（均P＜0.05），且滅活后各項目的檢測結果顯著低于滅活前。見表1。

表1 50例體檢者56 ℃加熱30 min滅活前后血清AMY、ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU比較（U/L）

2.2 56 ℃加熱30 min 滅活前后一致性分析 由于血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU 這7 個項目滅活前后檢測結果差異有統計學意義（均P＜0.05），因此本研究應用Bland-Altman 圖進行臨床可接受的一致性判斷，結果顯示：血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU 項目在滅活前與滅活后結果差值最大點的偏倚分別為54.05%、16.67%、94.74%、20.00%、23.67%、73.33%、391.75%，均超出其1/3TEa（ALT=5.33%，AST=5.00%，ALP=6.00%，GGT=3.67%，LDH=3.67%，ADA=8.33%，AFU=6.00%），且超出臨床可接受范圍的結果數量均大于20.00%，故上述7 項酶學項目的檢測結果在滅活前后不具有一致性。見圖1。

圖1 50例體檢者血清樣本熱滅活前后Bland-Altman一致性分析。A為ALT熱滅活前后Bland-Altman一致性分析，B為AST熱滅活前后Bland-Altman一致性分析，C為ALP熱滅活前后Bland-Altman一致性分析，D為GGT熱滅活前后Bland-Altman一致性分析，E為LDH熱滅活前后Bland-Altman一致性分析，F為ADA熱滅活前后Bland-Altman一致性分析，G為AFU熱滅活前后Bland-Altman一致性分析

3 討 論

實驗室血清學指標的檢測在COVID-19 的診斷、治療效果監測、預后評估等方面發揮了至關重要的臨床作用［9-11］。《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》中明確指出，未經滅活處理的COVID-19 患者的血液標本需在具備二級生物安全的實驗室進行操作，且操作人員應嚴格采取三級防護措施，以減少病毒在實驗室內擴散或感染的風險［12］。但由于實驗室條件所限，即不具備專職人員處理COVID-19患者的標本及專用檢測設備，故實驗室人員在操作過程中存在潛在感染的風險。 因此，如果對COVID-19 患者的標本采取病毒滅活（56 ℃加熱30 min）處理后再行檢測，則可以避免實驗室人員職業暴露的潛在風險。

依據納入標準和排除標準，本研究將50 例符合要求的健康體檢者納為研究對象，并模擬了SARS-CoV-2 的滅活條件（56 ℃加熱30 min），對滅活前、滅活后血清標本的酶學項目的檢測結果進行了統計分析，結果顯示：熱滅活標本的處理方式對血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA 和AFU 這7 個項目的檢測結果具有顯著影響，僅血清AMY 的檢測結果不受影響。此外，筆者又應用Bland-Altman 圖對差異有統計學意義的7 個項目進行了臨床可接受性的評價，且研究結果再次顯示：56 ℃加熱30 min 的滅活處理對血清酶檢測的影響超出了臨床可接受范圍，其滅活前后結果不具有一致性。劉兆宇等［13］對臨床常用生化指標和炎癥指標進行滅活前后的研究，其研究結果表明：ALT、ALP、GGT 的檢測結果受滅活條件的顯著影響，AMY 雖受滅活影響，但經回歸方程校正后，仍對臨床診斷有參考價值，該結論與本研究結果一致。劉長德等［14］針對樣本滅活前后38 項生化指標檢驗結果進行研究，其研究結果表明：LDH、AST 熱滅活前后的結果差異均無統計學意義（均P＞0.05），但大于20%的數據超出TEa，該結論與本研究相對一致。郭旺源等［15］在研究熱滅活對免疫球蛋白M 抗體和生化免疫檢測項目結果的影響時發現：ALT、LDH、ALP、GGT 等對熱敏感的酶學項目的檢測結果受滅活條件的影響大，而AST 滅活前后結果差異無統計學意義（P＞0.05），其結論與本研究存在一定差異。Pan 等［16］應用加熱滅活方式對COVID-19 患者的咽拭子和痰液標本處理后進行SARS-CoV-2 核酸檢測，其結果顯示：56 ℃加熱30 min的滅活方式嚴重降低了其檢測效能，甚至導致了假陰性的出現。基于上述報道和本研究結果存在的差異，筆者推測其原因可能為：⑴由于選擇的研究對象不同，其體內各項指標的基線水平存在潛在的不同所致；⑵酶的催化活性受多種因素影響，且不同的檢測系統，其檢測方法可能不同，進而導致檢測結果存在差異。

本研究也存在一定的局限性：⑴由于本研究所納入的對象為20～60歲健康成人，并非感染SARS-CoV-2的人群，故無法確定含有SARS-CoV-2 的血清對酶學項目是否存在一定的影響；⑵本研究所納入的研究例數相對較少，為得出更具代表性的結果，需進一步擴大樣本量。

總之，本研究認為56 ℃30 min 熱滅活的條件對血清酶學檢測結果具有潛在的影響。因此，筆者建議實驗室采用該條件處理臨床樣本時，需采取必要的措施以校正實驗數據，進而為臨床提供精準的檢測結果。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。