血管生成擬態與翼狀胬肉初發型及復發型的相關性

賀夢璇，楊鈴，張俊芳，秦柏，顧宏衛，唐秋陽，管懷進，石海紅

(南通大學附屬醫院眼科，江蘇 南通 226001)

翼狀胬肉是常見的眼表疾病之一，臨床上表現為瞼裂區球結膜與角膜上的一種贅生組織[1]。翼狀胬肉初期通常無不適或僅有輕微的干澀感、異物感等癥狀，當胬肉發展侵入角膜則會導致角膜散光[2]、視力下降，若增生組織越過瞳孔遮蓋視軸則會嚴重影響患者的生活質量。翼狀胬肉局部浸潤發展、術后易復發的行為學特點，以及微衛星不穩定性、雜合性丟失、p53基因突變及端粒酶表達上調等發病機制均與腫瘤相類似，故部分學者認為其是一種腫瘤樣病變[3]。VM是Maniotis等[4]于1999年在葡萄膜黑色素瘤中發現的一種腫瘤微循環模式，它是由高度侵襲性的腫瘤細胞通過自身變形及細胞外基質重塑形成，管腔無內皮細胞襯覆，且可與宿主血管相連通使腫瘤獲得血液供應[5]。VM的管壁呈PAS染色陽性，而血管內皮細胞標志物CD31則不表達，符合其不依賴血管內皮細胞的特性，因此CD31/PAS雙重染色常作為組織VM的檢測方法。有研究發現，VM也存在于翼狀胬肉組織中，參與胬肉的血液供應[6]，且VM與進展期翼狀胬肉呈顯著正相關[7]。但VM與翼狀胬肉復發的關系未見報道，本研究從組織水平及細胞水平對比初發型和復發型翼狀胬肉血管生成擬態的情況，以探討VM與翼狀胬肉復發的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2019年6月至2020年1月于南通大學附屬醫院眼科行翼狀胬肉切除手術患者的初發型翼狀胬肉標本105例，男35例，女70例，年齡(60.46±9.21)歲；以及2019年1月至2020年12月于本院行同一手術的復發型翼狀胬肉標本34例，男12例，女22例，年齡(63.47±9.66)歲；另選10例于本院捐獻眼球的正常結膜組織作為對照，男5例，女5例，年齡(68.20±8.52)歲。所有患者胬肉位于鼻側，且排除其他眼表疾病及眼部外傷史、手術史和長期用藥史，手術均由同一醫生完成，所取標本均為完整的翼狀胬肉組織。所有對照組患者無眼表疾病、眼部外傷史、手術史和長期用藥史。本研究遵循赫爾辛基宣言，通過南通大學附屬醫院倫理委員會審查批準，患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

檸檬酸鈉抗原修復液、PAS染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；GTVisionTMIII抗鼠/抗兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰荆籆D31抗體、Vimentin抗體、Cytokeratin抗體購自英國Abcam公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培養基及DMSO購自美國Gibco公司；Matrigel膠購自美國BectonDickinson公司；DM3000光學顯微鏡及顯微攝像系統購自德國Leica公司。

1.3 CD31/PAS 免疫組織化學雙重染色

將術中取下的正常結膜及翼狀胬肉組織用4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，以組織長軸連續縱切，制成厚度約為4 μm的切片，脫蠟至水，65 ℃烘箱中干燥40 min，PBST(含0.05%Triton-100的PBS溶液)漂洗3次，每次5 min，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復15～20 min，PBST漂洗5 min×3次，3%H2O2消除內源性過氧化物酶活性20 min(避光)，PBST漂洗3次，每次5 min，10%山羊血清封閉40 min，不洗，加入CD31(1:50)一抗，4 ℃孵育過夜。復溫，PBST漂洗3次，每次5 min，滴加抗鼠/抗兔通用型二抗 37 ℃孵育30 min，PBST漂洗3次，每次5 min，DAB顯色，蒸餾水浸洗，高碘酸氧化5 min，蒸餾水浸洗，Schiff氏液避光染色10 min，蒸餾水浸洗，蘇木精染核5 min，稀鹽酸乙醇分化2～5 s，自來水漂洗，蒸餾水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，自然干燥后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.4 人翼狀胬肉成纖維細胞原代培養及鑒定

將手術切除的新鮮翼狀胬肉組織用含1%青霉素-鏈霉素的PBS緩沖液漂洗3次，洗凈血液，去除上皮，剪碎，加入0.08%胰蛋白酶-EDTA，室溫消化8 min后終止，1 500 r/min離心5 min棄上清，利用牙科探針將組織小塊均勻接種于培養瓶內，加入少許完全培養基，將培養瓶底朝上置于37 ℃，5%CO2培養箱中，24 h后待組織小塊貼壁，加入適量完全培養基，緩慢翻轉培養瓶，靜置培養，每3 d換液一次。

取傳至第二代的細胞接種爬片，4%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，0.2%Triton-100通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，消除內源性過氧化物酶活性、封閉同1.3，加入Vimentin(1:500)、Cytokeratin(1:50)及PBS(陰性對照)，4 ℃孵育過夜。復溫，PBS漂洗3次，每次5 min，二抗37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min，DAB顯色，染核，分化，返藍，脫水，透明，封片，觀察同1.3。

1.5 細胞三維培養及PAS 染色

取出Matrigel膠，4 ℃解凍過夜。將Matrigel膠以50 μL的體積緩慢加至96孔板，不可產生氣泡。為避免Matrigel膠受熱凝固，所有操作必須在冰上進行，且所用的槍頭及96孔板均需預冷。將鋪好膠的96孔板置于37 ℃孵箱內30 min使其固化。將初發型HPFs及復發型HPFs分別以1×105個/孔的數量接種于Matrigel膠上，置細胞培養箱內培養5 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞的管狀結構排列及成管的完整程度，隨機取3個不同視野(×100)計數成管的數量，計算平均值。觀察完成后，將上述培養5 h后的細胞行PAS染色。染色步驟為高碘酸氧化5 min，蒸餾水稍洗，Schiff氏液避光染色10 min，稀鹽酸酒精分化2～5 s，水洗2次。

1.6 統計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差()表示。計量資料采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用Pearson Chi-Square檢驗，雙變量相關性分析采用Spearman’s相關性分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VM 在翼狀胬肉中的表達

CD31/PAS免疫組織化學雙重染色結果見圖1，可見血管內皮細胞CD31染色陽性呈棕黃色，管壁PAS染色陽性呈紫紅色，為具有內皮細胞的正常血管；CD31染色陰性，PAS染色陽性的管道狀結構，是VM的特有形態。本研究統計得出，10例正常結膜均未見VM結構，初發型翼狀胬肉VM陽性率43.81%(46/105)，復發型翼狀胬肉VM陽性率82.35%(28/34)，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。Spearman’s相關性分析顯示VM與復發型翼狀胬肉(r=0.332，P<0.001)呈顯著正相關。

表1 翼狀胬肉中VM的表達Table 1 Expression of VM in pterygium

圖1 翼狀胬肉中VM的表達(×400)Figure 1 Expression of VM in pterygium (×400)

2.2 VM 在翼狀胬肉中的表達與患者一般資料的關系

根據患者的性別、年齡及病程，分別觀察VM在不同指標分組中的表達情況。Pearson Chi-Square檢驗結果提示，不同性別、年齡及病程的翼狀胬肉患者VM的表達差異均無統計學意義(均P>0.05，表2)。

表2 翼狀胬肉VM與患者一般資料的關系Table 2 Correlation between the VM and the general information of pterygium patients

2.3 HPFs 原代培養及鑒定

翼狀胬肉組織塊接種后10 d，初發組可見細胞從組織塊向周圍發散爬出，數量較少，分布較為零星(圖2A)。復發組爬出的細胞較初發組多，且相互連接，細胞形態多為長梭形、三角形，逐漸向四周延伸(圖2B)。由于成纖維細胞對胰酶的耐受性較差，故當細胞傳至第2代時已基本純化，細胞呈長梭形，長滿后呈旋渦狀(圖2C)。免疫細胞化學染色結果顯示PBS空白對照組及Cytokeratin染色均為陰性(圖3A，3B)，Vimentin染色陽性，表現為胞質棕黃色(圖3C)，符合成纖維細胞特性。

圖2 HPFs原代培養(×100)Figure 2 Primary culture of HPFs (×100)

圖3 HPFs鑒定(×200)Figure 3 Identification of HPFs (×200)

2.4 不同類型HPFs 構建VM 的差異

細胞三維培養結果顯示：HPFs能夠黏附于Matrigel膠表面，通過細胞自身變形、彼此相連形成大小不等的網格樣、環狀管腔結構，且PAS染色呈陽性，提示管腔樣結構是由HPFs構成，即VM結構(圖4A)。圖4B可見復發型HPFs所構成的VM管腔較初發型大，且數量較初發型多。初發型和復發型HPFs形成VM的個數分別為21.00±2.65、30.33±1.53，差異具有統計學意義(t=?5.292，P=0.006；圖4C)。

圖4 HPFs構建體外VM模型(×100)Figure 4 VM model was constructed by HPFs in vitro (×100)

3 討論

翼狀胬肉是全球范圍內較為多發的眼科疾病[8]。據最新統計，中國40歲及以上人群翼狀胬肉患病率為13.4%[9]，處于較高水平，且隨著年齡的增長而不斷升高，好發于長期紫外線暴露的人群，日光、粉塵等的慢性刺激[10]可能是其主要誘因。翼狀胬肉類腫瘤樣特性為其表達VM奠定了一定的理論基礎。

VM是最新發現的腫瘤微循環模式，其主要特點如下[11-12]：1)管道由腫瘤細胞及細胞外基質構成；2)管腔內壁沒有血管內皮細胞襯里；3)腫瘤細胞變形成條索狀并模仿正常血管結構圍成管腔，可輸送血液；4)腫瘤細胞在管壁成分外表面排列；5)管道周圍無明顯的炎癥細胞浸潤。許多學者發現，VM表達陽性的腫瘤存在更強的侵襲、轉移及復發的能力[13-14]。目前，在乳腺癌[15]、卵巢癌[16]、肺癌[17]、前列腺癌[18]、肝癌[19]等許多惡性腫瘤中均檢測到VM結構。VM的管壁呈PAS染色陽性，而血管內皮細胞標志物CD31則不表達，符合其不依賴血管內皮細胞的特性，因此CD31/PAS雙重染色常作為組織VM的檢測方法。

本研究采用CD31/PAS雙重染色檢測翼狀胬肉中的VM結構，結果顯示：翼狀胬肉中存在VM結構，而正常結膜中未見，且復發型翼狀胬肉VM陽性率大于初發型，VM與復發型翼狀胬肉呈顯著正相關。本研究結果與李永平等[6]的結論共同支持了“VM結構不是腫瘤組織所獨有的血供模式”這一觀點。推測VM是由于機體局部組織由于某些原因需要大量的營養供應，但自身血管不能滿足其需要而形成的一種供給方式。復發型翼狀胬肉組織中細胞增殖水平較初發型翼狀胬肉顯著升高[20]，即復發型胬肉進展速度快、時間短，需要較多的血液供應，故VM形成率較高。同時，VM結構的產生，使胬肉獲得充分的血液供應，進一步促進了翼狀胬肉的進展。一般資料統計結果得出，不同性別、年齡及病程的翼狀胬肉患者VM的表達無顯著差異。這些結果與腫瘤組織中VM陽性者具有更強的侵襲及復發的能力，VM陽性率與腫瘤患者一般資料無顯著相關性相對應。

李永平等[6]指出，翼狀胬肉VM主要表現為PAS陽性的細胞外基質包繞在成纖維細胞伸出的突起表面形成的管道狀結構，即成纖維細胞是構成翼狀胬肉VM的主要成分，因此本研究使用原代培養的HPFs構建體外VM。對于體外培養的腫瘤細胞而言，其可與Matrigel基質膠或鼠尾I型膠原蛋白等模擬的細胞外基質成分一起構建體外細胞培養的三維模型，如果腫瘤細胞可以在Matrigel基質膠或鼠尾I型膠原蛋白中通過自身變形、彼此相互連接而圍成環狀、網狀結構，且可被PAS染成紫紅色，則可將其認定為VM結構，這種方法常被用來作為體外VM的檢測。本研究發現：在翼狀胬肉中，具有侵襲性的HPFs也能夠黏附于Matrigel基質膠表面，通過細胞自身變形、彼此相連形成大小不等的網格樣、環狀管腔結構，且PAS染色呈陽性，提示HPFs具有在體外形成VM結構的能力，進一步驗證了李永平等[6]的觀點。經過對初發型及復發型HPFs構成VM管腔數量的統計得出，復發型HPFs構成的VM管腔數量明顯較初發型多。可能原因是復發型翼狀胬肉向角膜及深層浸潤發展迅速[21]，其成纖維細胞具有更強的侵襲及遷移能力，故可形成較多的VM結構。

綜上所述，翼狀胬肉組織中存在VM結構，可作為其血供途徑之一，且復發型翼狀胬肉VM陽性率及復發型HPFs構建VM的數量均高于初發型，即VM與翼狀胬肉的復發密切相關。因此，進一步研究針對VM的靶向藥物，可能對預防翼狀胬肉復發具有重大意義。

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