芫花水提物對斑馬魚肝臟毒性機制研究

趙崇軍 李二文 李芝奇 范琦琦 魏靜 趙霞 林瑞超

芫花(FlosGenkwa)為瑞香科植物芫花的干燥花蕾，廣泛分布于中國長江流域各省和黃河流域的部分地區，具有瀉水逐飲、殺蟲療瘡的功效[1]。現代藥理學研究表明，芫花具有鎮痛抗炎[2-3]、免疫調節[4]、抗腫瘤[5]等諸多藥理作用，但毒性限制了其臨床應用。現有研究表明芫花對多個臟器存在毒性作用，向麗華等[6]研究24種中藥的長期毒性，表明芫花對肝臟、肺、腎臟、卵巢等七個臟器存在毒性作用；趙一等[7]研究表明芫花對家兔具有顯著的皮內刺激性和眼結膜刺激作用。可見芫花的毒性越來越受重視。肝臟是藥源性損傷的主要靶器官之一，而中藥是引起慢性藥物肝損傷的重要原因之一[8]，目前基于傳統用藥方式對芫花水提物的肝損傷研究尚且有限。本實驗室前期工作中基于斑馬魚模型已完成多種有毒中藥的評價，并且通過評價斑馬魚肝臟表型、肝面積、部分酶活性等指標，已確定芫花水提物會誘導斑馬魚幼魚肝臟腫大、出血、肝細胞凋亡等[9]，但其對斑馬魚肝臟的毒性具體機制尚不明確，本研究基于斑馬魚模型對芫花水提物的肝毒性機制進行深入探討，以期對芫花的臨床應用和推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚循環水養殖系統(北京愛生科技公司)；BX51熒光顯微鏡(日本奧林巴斯集團)；200 μL、1 mL、5 mL移液器(德國Eppendorf公司)；LRH-250Z型恒溫生化培養箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)；RJLDL-50G型離心機(無錫瑞江分析儀器有限公司)；HZQ-QX型全溫振蕩箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；HQ10-20H超純水儀(長沙聚豐環保科技有限公司)；Epoch2微孔板分光光度計酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；UV-2000紫外-可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)。Nanodrop 2000凝膠電泳結合紫外分光光度(美國賽默飛世爾科技公司)；QuantStudio 3熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

Caspase-3活性檢測試劑盒(北京拜爾迪生物技術有限公司，批號G015)，TransZol Up Plus RNA Kit (北京天根生化科技有限公司，批號ER501)，FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號KR116)，RNA保護液(北京拜爾迪生物技術有限公司，批號r1100)，4%多聚甲醛(北京生物科技有限公司，批號p1110)，油紅O染料(北京拜爾迪生物技術有限公司，批號s19039-100g)，丙二醇(北京拜爾迪生物技術有限公司，批號0575-4l)，丙三醇(北京虹湖聯合化工產品有限公司，批號1198677873)，甲酰胺(北京蘭博利德商貿有限公司，批號v900064-500 mL)，20×SSC緩沖液(pH=7.0，北京拜爾迪生物技術有限公司，批號r21057-100 mL)，蘇木素—伊紅染液(北京拜爾迪生物技術有限公司，批號d006)。芫花由安國圣山藥業有限公司提供，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為瑞香科植物芫花的干燥花蕾，且符合藥典規定。

斑馬魚親本購于中國科學院武漢水生生物研究所，實驗用野生AB系斑馬魚由本實驗室斑馬魚養殖系統繁育。

1.2 芫花樣品的制備

芫花水提物的制備：稱取50 g芫花置平底燒瓶中，加10倍量水回流提取2小時，過濾，再加10倍量水提取兩次，每次1小時。合并提取液，抽濾，濃縮，真空干燥，得芫花水提物16.59 g，得率為33.19%。

芫花水提物貯備液的配制：精密稱取研磨后的芫花水提物粉末0.1 g，置于50 mL離心管中，精密加入50 mL斑馬魚胚胎培養水，超聲60分鐘，配置成2000 mg/L的貯備液，分裝，置于-20℃的冰箱中保存備用。

芫花樣品暴露給藥溶液的配制：用胚胎培養水將貯備液稀釋至所需濃度即可。

1.3 斑馬魚幼魚的養殖與選取

斑馬魚的養殖：斑馬魚的養殖和繁育參照Zebrafish Book[10]。實驗操作遵循經濟合作與發展組織標準。斑馬魚保持在循環水養殖系統中，水溫(28±1)℃，pH值7.0～7.2，電導率450～550 μs/cm，光照/黑暗周期為14小時/10小時。成年斑馬魚每日喂食3次豐年蝦幼蟲。斑馬魚胚胎通過自然成對交配產生。選取成年斑馬魚雌雄(1∶1)放入帶隔板的產卵缸，次日早晨給予光照抽取隔板完成交配。將魚卵收集于無菌培養皿中，在顯微鏡下去除死的和未受精的胚胎，并用培養液清洗，加培養液置于生化培養箱中培養96小時，每24小時更換一次培養液。斑馬魚胚胎培養水的配置：按照Zebrafish Book標準配制[10]，0.137 mol/L的NaCl、5.4 mol/L的KCl、0.25 mol/L的Na2HPO4、0.44 mol/L的K2HPO4、1.3 mol/L的CaCl2、1.0 mol/L的MgSO4、4.2 mol/L的NaHCO3水溶液。

斑馬魚的選取：選取發育正常、無畸形的4 dpf AB系野生斑馬魚幼魚，隨機放于12孔細胞培養板中，每孔20條，加入適量等體積的胚胎培養水。

1.4 斑馬魚幼魚的藥物暴露處理

根據前期實驗結果，選擇200 mg/L、150 mg/L、100 mg/L濃度的藥液對斑馬魚進行暴露處理，每組尾數為20(實驗重復3次)。按照“1.2”藥液的配制原則，將貯備液稀釋成不同濃度的藥液。將裝有幼魚的12孔板中的培養水依次吸出，并快速加入4 mL不同濃度的藥液，孔板中的最終暴露濃度為高濃度組200 mg/L、中濃度組150 mg/L、低濃度組100 mg/L，空白對照組為等體積新鮮胚胎水。每個濃度含有2個復孔。加蓋標記后，將孔板置于可控溫光照培養箱中(28.5℃)24小時(黑暗與光照時間比為5∶7)，實驗終點即完成藥物暴露。

1.5 斑馬魚幼魚肝臟病理組織狀態的分析

為了觀察斑馬魚經藥物處理后肝臟組織的病理學形態，對其做石蠟切片以進行觀察。按照上述“1.4”的方法進行藥液暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用其胚胎培養水清洗3次，轉入預先稱重的1.5 mL離心管中，每個濃度20條幼魚，PBS清洗3次，移除PBS，將收集好的魚體固定于4%的多聚甲醛緩沖液中12小時，流水沖洗4小時。然后進行脫水、透明處理，石蠟包埋，切成6 μm的薄片，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法，處理溫度為室溫。最后置于顯微鏡下觀察[11]。

1.6 斑馬魚幼魚肝臟脂肪堆積狀態的觀察

按照上述“1.4”的方法進行藥物暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用其胚胎培養水清洗3次，轉入預先稱重的1.5 mL離心管中，每個濃度80條幼魚，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，移除PBS，將收集好的魚體固定在4%的多聚甲醛中，4℃條件下過夜。固定之后，將幼魚轉移到12孔板中，使用1×PBS沖洗后，使用混合溶液進行漂白：6 mL無菌水、30%的雙氧水3.3 mL、0.5 mL甲酰胺、20×SSC的緩沖液0.25 mL。使用1×PBS沖洗后，依次使用85%和100%的丙二醇進行滲透，每次10分鐘，隨后浸沒在0.5%油紅O中，在黑暗的條件下過夜染色。隨后依次使用100%和85%丙二醇進行沖洗，脫色，每次30分鐘。隨后用1×PBS進行沖洗，保存在80%丙三醇中[12]，置于顯微鏡下觀察拍照，觀察是否有脂肪的堆積。所有油紅染色操作都需要在常溫下的緩慢振蕩器中進行。

1.7 斑馬魚幼魚基因表達的分析

按照上述“1.4”的方法進行藥液暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用胚胎培養水清洗3次，轉入含有1 mL RNA保護液的1.5 mL離心管中，每個濃度80條幼魚，在-80℃下貯存至測定。使用TransZol Up Plus RNA Kit提取總RNA。通過凝膠電泳和UV分光光度計驗證RNA樣品的完整性。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將來自不同組的等量總RNA樣品逆轉錄為cDNA。使用CFX96 Touch Systems和TransStart Top Green qPCR Super Mix進行定量實時PCR分析。所有過程均根據不同套件提供的制造商說明進行。用于PCR的斑馬魚特異性引物使用Primer Premier 5.0軟件(表1)設計并由生物醫學(北京博邁德基因技術有限公司)生產。兩步PCR擴增方案如下：95℃ 3分鐘、95℃ 30秒、60℃ 60秒，然后40個循環。

表1 引物序列

1.8 斑馬魚幼魚Caspase-3活性檢測

按照上述“1.4”的方法進行藥液暴露處理，在實驗終點將12孔板中的斑馬魚幼魚用其胚胎培養水清洗3次，轉入預先稱重的1.5 mL離心管中，每個濃度80條幼魚，PBS清洗3次，移除PBS，迅速稱重并將樣本保存于-80 ℃，按照每50 mg樣本組織加入50 μL裂解工作液將斑馬魚組織樣本裂解勻漿，4℃、12000 r/min離心5分鐘，吸取上清液轉移至新的離心管中，立即測定Caspase-3的酶活性，同時取少量樣本用Bradford法測定蛋白濃度。Caspase-3酶活性的測定步驟按照試劑盒操作說明進行，最后用酶標儀測定405 nm處的吸光值。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 斑馬魚幼魚肝臟組織病理學的改變

實驗結果顯示，空白對照組肝臟區域的細胞完整，細胞質均勻，細胞核成規則圓形；高濃度組中，肝臟細胞結構改變，肝實質細胞減少，出現萎縮變形，部分區域可見胞質溶解造成空泡化，排列松散，肝臟區域部分界線模糊。如圖1所示。

注：A：空白對照組×100；B：空白對照組×400;C：高濃度組×100；D:高濃度組×400

實驗結果顯示，空白對照組斑馬魚肝臟部分未被著色，高濃度組斑馬魚肝臟區域呈現紅色。如圖2所示。

注：A：空白對照組；B：高濃度組。

2.2 斑馬魚幼魚基因表達的改變

實驗結果顯示，相對于空白對照組，給藥組中內質網應激相關基因包括激活轉錄因子4(activating transcription factor 4，atf4a)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、90KDA熱休克蛋白Β，內質網核心信號1(endoplasmic reticulum to nucleus signalling 1，ern1)、熱休克蛋白70成員5[heat shock protein family A (Hsp70) member 5，hspa5]、真核翻譯起始因子2A激酶3(recombinant eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 3，eif2ak3)、EIF2S1蛋白磷酸化抗體對(protein phosphorylation antibody pair，eif2s1)的mRNA表達水平顯著上調；三羧酸循環相關基因丙酮酸脫氫酶E1α亞單位基因(pyruvate dehydrogenase E1 α-subunit A，pdha1a)和糖酵解相關基因肝紅細胞丙酮酸激酶(recombinant human pyruvate kinase, Liver And RBC，pklr)在給藥組中表達下調；肝型脂肪酸結合蛋白基因肝型—脂肪酸結合蛋白(liver-fatty acid binding protein，L-FABP)的mRNA表達水平上調；瘦素受體(leptin receptor，Lepr)和視黃醇結合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)基因的mRNA表達水平上調；解偶聯蛋白2(uncouplingprotein 2，ucp2)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，sod1)基因的mRNA表達水平下調；炎癥細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)上調；自噬相關基因自噬基因(beclin)、自噬相關蛋白3(autophagy related 3 homolog，ATG3)下調；B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族成員中抑制細胞凋亡的Bcl-2基因表達下調，促進細胞凋亡的Bid基因表達上調。實驗結果如表2所示。

表2 不同濃度芫花水提物對斑馬魚幼魚基因相對表達量的影響

2.3 斑馬魚幼魚Caspase-3活性檢測

實驗結果表明，與空白對照組相比，芫花水提物高濃度組的斑馬魚幼魚Caspase-3活性升高，并具有顯著性差異(P<0.05)。如表3所示。

表3 不同濃度芫花水提物對斑馬魚幼魚

3 討論

國際上常規的毒理學研究終點均因傳統評價模型的靈敏性、穩定性和特異性較差而無法成為肝毒性早期診斷的標準。而本實驗采用斑馬魚為模型，斑馬魚作為新興的藥物安全性評價的模式生物，介于體外細胞等實驗和體內整體動物實驗之間，既具有細胞等體外實驗用藥量少、實驗費用低、周期短、高通量等特點，又具備整體動物實驗可觀察多個器官、可評價藥效學及藥動學、可評價代謝物活性等優勢，其繁殖快、易飼養、胚胎及幼魚透明且便于觀察等優勢也不可忽視[13]，非常適合在藥物開發的早期階段預測藥物的肝毒性，并且斑馬魚與人類基因組的相似度高達87%，有與人類近似的毒性特征和信號傳導通路，對外源化學物質的防御機制與哺乳動物相當，包括酶的誘導和氧化應激[14]。

實驗室前期工作探究芫花提取物的毒性作用，實驗結果發現從斑馬魚幼魚的表型、生化指標等的變化證明芫花對斑馬魚造成肝臟損傷，再從其生化指標超氧化物歧化酶、過氧化氫酶推測其可能是通過破壞機體的氧化應激平衡造成肝損傷[9]，但具體的損傷程度及機制尚不明確，本研究緊接著對芫花肝臟毒性機制做進一步探討。通過病理切片和脂肪堆積狀態的結果可以看出，芫花對斑馬魚肝臟的毒性作用表現在肝臟細胞結構改變，部分區域嚴重空泡變性，排列松散；肝臟及卵黃囊處有脂肪堆積。為了明確這一病理變化，本課題組研究了芫花水提物對斑馬魚幼魚的潛在毒性機制，結果表明，其潛在機制與內質網應激，線粒體功能障礙，氧化應激，先天免疫應答和細胞凋亡等相關。

內質網是細胞加工蛋白質和貯存Ca2+的主要場所，其對蛋白質的合成、折疊以及轉運等過程發揮重要作用。但一些病理因素可能會破壞內質網功能，從而誘發內質網應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)，甚至是造成細胞的凋亡。內質網應激反應主要激活3條細胞信號通路：未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)、內質網超載反應(endoplasmic reticulum-overload response，EOR)及固醇調節級聯反應。其中，URP是內質網應激反應中最重要的信號通路[15]。ERS和URP相關的基因包括atf4a, hsp90b1, eif2s1，在芫花水提物的誘導下，這些基因在斑馬魚中顯著上調。而且，有研究表明，內質網應激在脂肪肝的發生發展中起著重要的作用[16]，表明斑馬魚幼魚脂肪堆積也與內質網應激相關。L-FABP在肝細胞中可大量表達，其主要功能包括脂肪酸的轉運、核信號傳導及脂代謝作用[17]，給藥組中L-FABP表達上調，可能是由于斑馬魚脂質堆積增強了L-FABP的表達。Rbp4是一種脂肪細胞分泌因子，它在人類肝臟組織中表達最高，并且肥胖患者體內，Rbp4表達是升高的[18]。因此，L-FABP和rbp4的表達上調也說明斑馬魚體內有脂質堆積。

線粒體的主要功能包括調節氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成、Ca2+穩態等，并且參與多種重要營養物質的代謝[19]。三羧酸循環是在線粒體中進行的，本研究結果表明其相關基因pdha1a在芫花水提物誘導的斑馬魚肝臟中下調，表明三羧酸循環受阻，即線粒體功能可能受損。糖酵解途徑是將葡萄糖和糖原降解為丙酮酸并伴隨ATP生成的一系列途徑，產生的丙酮酸將進入線粒體繼續氧化分解，通過三羧酸循環及電子傳遞鏈徹底氧化成二氧化碳和水，并生成ATP。因此糖酵解會影響線粒體產生能量，其相關基因pklr表達水平的下調說明糖酵解受到抑制，影響線粒體產能。Ucp-2是線粒體膜內陰離子載體超家族的成員。它通過一種不完全明確的機制調節脂肪酸代謝和活性氧的生成，以減少線粒體電子傳輸過程中ROS的生成[20]。超氧化物歧化酶具有特殊的生理活性，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，是氧自由基的自然天敵。本研究結果顯示芫花水提物誘導ucp2和sod1基因表達的下降，ROS增多，導致斑馬魚體內的氧化和抗氧化作用失衡，從而導致氧化應激。在內質網應激和氧化應激的損傷下，對免疫應答相關基因和自噬相關基因進行研究，發現IL-1β、TNF-α表達在給藥斑馬魚組中上調，Beclin和ATG3則下調。IL-1β和TNF-α分別作為白介素IL-1家族中的促炎活性因子和參與全身性炎癥的腫瘤壞死因子，其表達水平的上調與肝臟損傷密切相關。Bcl-2定位于自由基生成的位點，作為抗氧化應激的明顯抗氧化劑，可以防止細胞凋亡[21]；Caspase-3是最為關鍵的細胞凋亡執行者，在細胞凋亡過程中起著不可替代的作用[22]。Bcl-2基因表達水平的下調，促進細胞凋亡的Bid基因表達上調及Caspase-3活性的升高均說明芫花水提物誘導斑馬魚幼魚的肝臟細胞凋亡。

綜合實驗結果，芫花水提物誘導斑馬魚幼魚的肝損傷，造成肝臟代謝功能異常，導致脂肪堆積。基因結果顯示其可能通過誘導內質網應激，破壞線粒體功能，誘導氧化應激及產生炎癥反應最終導致細胞凋亡。本研究結果更加清楚地了解了芫花在斑馬魚幼魚中的毒性作用及潛在機制，為后續的研究工作及芫花的臨床應用推廣提供一定的參考依據。