扶正透邪方對耐藥銅綠假單胞菌肺炎大鼠晚期炎癥反應的影響

張迪 晏軍 錢瑩 姚興偉 付躍峰 郭楠 劉清泉 孔令博

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是醫院環境中最主要的病原菌，PA引起的院內肺炎占到院內肺炎病例的18%以上，最新研究顯示，院內肺炎的死亡率已經到了13%～50%[1-2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種重要的晚期炎性介質，受到PA刺激后，單核巨噬細胞將其分泌到細胞外環境發揮促炎作用。HMGB1通過促進核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)核轉位釋放炎癥細胞因子，如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)，炎癥細胞因子進一步促進HMGB1的釋放，形成一個正反饋回路，放大炎癥級聯反應[3-5]。耐藥PA肺炎在感染途徑、發病特點和病機上與中醫學伏邪理論存在高度的一致性。扶正透邪方扶正以助透邪，透邪以助扶正，針對耐藥PA肺炎有益氣養血、透邪外出之功。前期研究證明扶正透邪方在早期可升高體內白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平，刺激促炎因子釋放，幫助清除細菌和毒素[6]，但對后期的炎癥反應研究不足。本實驗通過觀察扶正透邪方對耐藥PA肺炎HMGB1水平的影響，及NF-κB和IL-6等相關細胞因子的表達，進一步探討扶正透邪方對耐藥PA肺炎的作用機制，為臨床應用提供依據，同時豐富伏邪理論的科學內涵。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

扶正透邪方組成：黃芪60 g、當歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g，以上藥物均為中藥全成分免煎顆粒，由北京康仁堂藥業有限公司提供。

1.2 實驗菌株

耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株，樣本號：20PXSP1925，經北京中醫藥大學東直門醫院細菌室進行菌種鑒定與藥敏檢測。

1.3 試劑與儀器

HMGB-1(批號：SEA399Ra)、IL-6 ELISA(批號：SEA079Ra)檢測試劑盒，購自武漢云克隆科技股份有限公司；UltraPure Agarose(批號：16500100)、SuperScript III RT 逆轉錄kit(批號：11752050)、Sybr qpcr mix(批號：4472920)，均購自美國ABI-invitrogen；HMGB1抗體(批號：Ab79823)、NF-κB抗體(批號：Ab76311)，購自英國Abcam公司。酶標儀Microplate reader，ELx808，美國Biotek；熒光定量PCR儀，StepOne Software，美國Applied biosystems；SDS-PAGE電泳系統，Mini-PROTEAN?Tetra Cell with Mini Trans-Blot?Module And PowerPacTMUniversal Power Supply，美國BIO-Rad；凝膠成像系統，GelDoc-It310，美國UVP；ChemiDoc MP化學發光成像系統，170-8280，美國BIO-Rad。

1.4 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠12只，雄性，體重(200±20) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SYXK(京)2020-0013。購入后置于微生物免疫動物室動物潔凈飼養。隨機分為空白組、模型組和扶正透邪組，共3組。每組各4只，各組按于7天后留取標本。動物實驗經北京盈科瑞生物醫藥研究所倫理委員會批準(批準號IACUC-YKRSW-2021-D001)。

1.5 模型制備、藥物干預

1.5.1 模型制備 大鼠予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4 g/kg，待大鼠完全麻醉后，用皮筋將其固定于木板上，用鑷子輕輕拉出大鼠舌頭，打開照明燈對準大鼠頸部，調整大鼠頭部位置，直到通過口腔可以看到聲門裂。用微量進液器抽50 μL菌液，緩慢將微量進液器針頭送入聲門裂，向氣管內緩慢滴注菌液。滴注菌液后迅速將大鼠從鼠板上取下，雙手握住大鼠上肢，使大鼠直立，并左右搖擺，使菌液均勻分布于大鼠左右兩肺[7]。空白組按上述方法在大鼠氣管內注入等量的無菌生理鹽水。造模過程中大鼠無死亡。

1.5.2 藥物干預 空白組予蒸餾水灌胃；模型組在感染后予蒸餾水灌胃；扶正透邪組在感染后予扶正透邪全方水煎劑灌胃，各組灌胃每日2次，每次2 mL。扶正透邪方組成：黃芪60 g、當歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g，根據Meeh-Rubner計算實驗動物的體表面積公式換算，每只大鼠使用藥物為黃芪1.15 g、當歸0.3 g、金銀花0.3 g、青蒿0.2 g、虎杖0.2 g，相當于臨床成人用量的0.019倍[8]。

1.6 檢測指標及方法

樣本制備：予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4 g/kg，麻醉后，常規消毒大鼠腹部皮膚，打開腹腔，分離腹主動脈，予一次性無菌采血針接5 mL空白采血管，進行取血，并留取肺組織。采血完畢后，空白采血管室溫放置1小時，再4℃放置1小時，離心，2500 r/min，20分鐘，分離血清，分裝后-70℃保存。將肺組織切成小塊，放入離心管中，置于-70℃保存。

1.6.1 病理切片 將肺組織制作石蠟切片，切片厚度4 μm，蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，顯微鏡下觀察肺組織病理形態變化。

1.6.2 酶聯免疫吸附測定 嚴格按照酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒說明書操作，檢測血清中HMGB1、IL-6的OD450吸光度值，根據標準平濃度-吸光度值曲線折算出實際濃度。

1.6.3 逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測 取待檢測樣品，按照Trizol試劑盒說明書步驟提取總RNA，純化后按照逆轉錄試劑盒SuperScript III說明書使其逆轉錄為cDNA，隨后按照實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)體系進行引物擴增。擴增完畢后，使用2-ΔΔCt法計算HMGB1、NF-κB mRNA的相對表達量。

1.6.4 蛋白質印跡法(western blot，WB)檢測 肺組織勻漿提取蛋白，稀釋后測定蛋白濃度上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳完成后進行轉膜處理。隨后將膜在室溫下封閉2小時，之后加入一抗抗體孵育1.5小時。一抗孵育完成后洗膜3次，再加入二抗抗體孵育2小時。最后將膜放至在顯影儀中避光顯影、拍照。

1.6.5 免疫組化檢測 將各組肺組織，以HMGB1、NF-κB一抗和山羊抗兔的二抗進行常規免疫組化染色。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠HE結果

空白組支氣管壁光滑完整，上皮細胞排列整齊，少量炎癥細胞浸潤；模型組氣管壁充血水腫、管腔狹窄，肺泡腔縮小，大量炎癥細胞浸潤，上皮細胞排列紊亂、脫落；扶正透邪組管壁較模型組光滑，氣管壁腫脹、管腔狹窄和炎癥細胞浸潤數量較模型組明顯減輕。見圖1。

注：A為空白組；B為模型組；C為扶正透邪組

2.2 各組大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比較

ELISA結果示：模型組外周血中HMGB1和IL-6的含量均明顯高于空白組(P<0.05)，扶正透邪組外周血中HMGB1和IL-6的含量均明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比較

2.3 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的mRNA表達

模型組肺組織中HMGB1、NF-κB mRNA表達量明顯高于空白組(P<0.05)，扶正透邪組HMGB1、NF-κB mRNA明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的mRNA表達

2.4 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達

模型組肺組織中HMGB1、NF-κB蛋白表達量明顯高于空白組(P<0.05)，扶正透邪組HMGB1、NF-κB蛋白表達量明顯低于模型組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達

圖2 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達

2.5 免疫組化

空白組HMGB1表達較弱，模型組HMGB1表達較強，扶正透邪組HMGB1表達較模型組減弱，深棕色為HMGB1表達陽性細胞，見圖3。空白組NF-κB表達較弱，模型組NF-κB表達較強，扶正透邪組NF-κB表達較模型組減弱，深棕色為NF-κB表達陽性細胞，見圖4。

注：A為空白組；B為模型組；C為扶正透邪組(深棕色為HMGB1表達陽性細胞)

注：A為空白組；B為模型組；C為扶正透邪組(深棕色為NF-κB表達陽性細胞)

3 討論

伏邪是指感受邪氣，即時不發，伏藏于體內，逾時而發。研究伏邪理論發現耐藥菌感染在感染途徑、發病特點和病機上存在高度一致性[9]。伏邪的祛除強調“透邪”，透邪主要有兩層含義：一是要用透的方法給邪以出路，透達邪氣[10]；二是祛邪要除透、除盡，避免未除之邪繼續伏留體內，耗傷正氣。在伏邪的治療上，扶正亦是關鍵。抗生素多屬寒涼，加之伏邪發病多有發熱，苦寒之藥的使用，都會損傷人體陽氣，因此在治療上溫陽助陽就顯得尤為重要。正如柳寶詒的《惜余醫案》所說：“若惟取其陰而不鼓動其陰中之陽,恐邪機仍冰伏不出。擬于大劑養陰托邪之中,佐以鼓蕩陽氣之意,俾邪機得以外達三陽為吉[11]。”因此伏邪的治療以扶正透邪為主，扶正以助透邪，透邪以助扶正。劉清泉教授經過幾十年臨床實踐和對伏邪理論的深入研究，博采眾方，提出以扶正透邪方治療耐藥銅綠假單胞菌肺部感染，為臨床耐藥菌感染治療拓寬了思路[12]。方中以黃芪、當歸、金銀花為主藥，黃芪健脾補中，升陽舉陷，其扶正助氣功效可使邪熱外透、托毒外達，因此劑量最大；金銀花散熱解毒，善于透血分熱邪于外轉入氣分；當歸補血活血，兼能行血；青蒿清透虛熱、涼血除蒸，可治療病邪在氣分、血分之病，虎杖清熱化瘀。大劑量黃芪與當歸相配，如《內傷外辨惑論》的當歸補血湯，是經典的氣血雙補之方，方中重在黃芪大補肺脾以資氣血生化之源，配以當歸以補氣生血，令血氣充盈，陰平陽秘，可針對熱病日久，耗氣及血而致氣虛血虧、氣滯血瘀之證，并可退虛熱；黃芪與金銀花相配為外科瘡瘍方中常用配伍，意在益氣和營清熱，兩藥相配性甘味稍涼，即免苦寒耗損氣陰，又可透邪外出。當歸、金銀花取自四妙勇安湯，有通利血脈、活血補血、透邪外出之意。全方補而不膩，給邪以出路，從而達到益氣養血，透邪外出之功。

耐藥銅綠假單胞菌感染引起的炎癥反應分為早期和晚期，早期反應以促炎為主，主要促炎因子有TNF-α、IL-1β等。研究發現，扶正透邪方在早期可升高體內IL-1β水平，刺激促炎因子釋放，幫助清除細菌和毒素[6]。但對晚期炎癥因子的研究較少，晚期如果炎癥得不到控制，啟動炎癥信號級聯傳遞，會導致病情加重，死亡率升高。HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體蛋白，在細胞內、外微環境中起著不同的作用，是典型的炎性反應晚期調節因子[13]。研究發現，PA感染的COPD患者HMGB1呈高表達水平，且隨感染加重肺功能損傷進一步加重，血清中HMGB1水平也隨之增高[14]。升高的HMGB1可以和PA的膜成份LPS結合，同時作為轉移分子將二者復合物帶到CD14和TLR4，作用于TLR4下游信號通路，導致NF-κB激活，促進TNF-α、IL-1β等炎癥基因轉錄，引起炎癥反應[15- 16]。丁軍穎等[17]觀察PA肺炎大鼠免疫功能時發現PA肺炎大鼠HMGB1及效應分子IL-1β、TNF-α均明顯升高，對PA感染大鼠使用HMGB1拮抗劑可明顯減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放[18]。HMGB1還可損害巨噬細胞的吞噬能力，增加感染PA小鼠的死亡率，GTS-21可以抑制HMGB1釋放從而增強巨噬細胞的功能，提高細菌清除率，減少肺損傷[19]。以上研究表明HMGB1在PA肺炎中發揮重要作用。本研究發現，與空白組比較，模型組HMGB1基因和蛋白表達水平均升高，同時伴有肺組織損傷，與以上結果相一致。在此基礎上，扶正透邪方可降低HMGB1基因和蛋白的表達，改善肺組織損傷情況，說明扶正透邪方可減輕PA感染晚期炎癥反應，保護肺組織。

NF-κB是目前研究最多的炎癥相關通路之一，NF-κB信號通路活化與機體炎癥因子分泌密切相關。研究表明，給予肺上皮細胞銅綠假單胞菌LPS處理后，可以明顯活化NF-κB信號通路，表明NF-κB是引起機體炎癥反應的重要原因[20]。HMGB1分泌到細胞外環境中后可結合多種受體激活NF-κB信號通路，如HMGB1與RAGE結合后，引發Ras、PI3K和Rho的激活，并成為下游NF-κB激活的主要信號分子[21]。HMGB1也可與TLR4結合，激活NF-κB，引起下游的炎癥介質釋放[22-23]。HMGB1也可與TLR9相互作用，通過與TLR9結合引導MyD88和NF-κB的下游途徑發出信號，促進細胞因子的釋放[24]。因此，HMGB1可以通過與多種受體結合激活NF-κB，進而轉錄促炎基因，如IL-1、IL-6和TNF-α等，發揮促炎作用[25]。IL-6在感染性病變中產生，并向全身發出警告信號。HMGB1被PRR識別后刺激包括NF-kB在內的一系列信號通路，并增強IL-6等炎性細胞因子mRNA的轉錄[26]。使用HMGB1抑制劑甘草酸，或使用HMGB1小干擾RNA(siRNA)可以有效地抑制HMGB1介導的TLR4/NF-kB途徑[27-30]。雖然關于PA肺炎與HMGB1的研究很少，但在PA感染角膜炎的小鼠中使用siRNA沉默HMGB1后，可以降低NF-κB及下游炎癥因子的表達[31]，說明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是PA肺炎后期炎癥反應的重要通路。本研究發現，與空白組相比較，模型組HMGB1、NF-κB的基因和蛋白表達量均升高，同時IL-6水平也升高，說明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是大鼠晚期炎癥反應的通路之一。扶正透邪方可以降低PA肺炎大鼠HMGB1、NF-κB基因和蛋白表達，同時降低IL-6水平，在炎癥的晚期發揮作用。

本研究從動物實驗出發，探討了扶正透邪方對耐藥PA肺炎大鼠晚期炎癥反應的影響，表明扶正透邪方可以減少PA肺炎晚期炎癥因子的釋放，保護肺組織。由于HMGB1的受體較多，因此對于HMGB1作用于NF-κB及NF-κB后續調控IL-6釋放等過程研究不足，有待進一步的研究。

綜上所述，扶正透邪方可以減少HMGB1釋放來抑制NF-κB的核轉位，進而抑制IL-6的釋放，可能通過HMGB1/NF-κB/IL-6通路起到控制晚期炎癥反應水平，保護肺組織的作用。提示扶正透邪方可以有效調節機體的晚期炎性免疫應答，進一步闡釋了扶正透邪方作用機制，豐富了伏邪理論，但具體反饋調節機制有待進一步的研究揭示。