基于TLR4/NF-κB通路研究益氣活血藥對心梗大鼠心室功能的影響

馮鵬飛 郭書文 魏路路 王惠 劉云柯 魏梵域

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是嚴重的心血管疾病，病死率較高，根據《中國心血管病報告 2018》顯示，中國心血管病患病率持續上升、心血管病死亡率仍居首位[1]，其中MI是重要致死因素。心肌梗死后心力衰竭是常見且嚴重的合并癥，其發生發展與心室重塑、炎癥反應等因素有關[2]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)介導TLR4/NF-κB信號通路，通過調節心肌細胞氧化應激和凋亡[3]、心肌纖維化[4]及炎癥反應[5]等參與心肌梗死相關的病理進程，與MI后心室功能的進展密切相關。課題組前期研究發現益氣活血藥對MI后心室功能具有保護作用，本研究將著重探討這種保護作用的發揮是否與TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應相關及其對腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)表達的影響，為益氣活血藥防止MI后心室功能進展障礙的機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用50只健康的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，SPF級，8周齡，體質量(200±20) g，從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買，生產許可證編號：SCXK(京)2016-0006。動物飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心。

1.2 藥物和器材

1.2.1 藥物制備 益氣活血藥由生黃芪30 g、生曬參10 g、當歸15 g、三七6 g、川芎15 g組成，該藥物已申請專利(專利申請號為 201610368030.7)。中藥材從北京中醫藥大學東直門醫院中藥房購入，根據口服水煎劑進行制備，浸泡、煎煮、濾過、回流提取后濃縮定容，調整藥物濃度到每毫升藥液含生藥0.82 g；陽性對照藥物培哚普利(雅施達)，施維雅天津制藥有限公司，國藥準字：H20034053，研磨后利用蒸餾水制備成溶液使用。

1.2.2 主要試劑和儀器 TLR4(Proteintech，貨號：19811-1-AP)、NF-κB(Abcam，貨號：Ab16502)；大鼠TNF-α(武漢華美，貨號：CSB-E11987r，96T)、大鼠MCP-1(武漢華美，貨號：CSB-E07429r，96T)、大鼠IL-6(武漢華美，貨號：CSB-E04640r，96T)檢測試劑盒；小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V8)，全景掃描儀(3DHISTECH公司，Pannoramic MIDI)，高分辨率小動物超聲系統(加拿大VisualSonics公司，Vevo770)，電泳儀(Bio-Rad公司，Mi-PROTEAN Tetra)等。

1.3 實驗造模

適應性喂養3天后，對實驗動物進行稱重，選擇體質量(200±20) g的35只大鼠進行造模。大鼠心肌梗死模型的制備采用結扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending，LAD)的方法進行[6]。麻醉用藥選擇1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、麻醉方式為腹腔注射；麻醉后對手術區進行備皮、消毒，并進行氣管插管；逐層剪開3～4 肋間皮膚并消毒，為避免出血，肌層采取鈍性分離；經氣管插管連接小動物呼吸機，鈍性分離3、4肋間肌肉開放胸腔，將心臟從心包膜中暴漏，使用 5/0 無菌帶線縫合針在左心耳與肺動脈圓錐間下2 mm 處結扎LAD及其伴行血管；結扎后心臟迅速復位，清理出血及排空氣體后閉合胸腔，逐層消毒并縫合，待大鼠恢復自主呼吸后拔掉氣管插管。假手術與造模手術操作大致相同，但假手術只進行穿線而不進行結扎。為防止感染，術后青霉素鈉預防用藥，每只 20 萬單位/天，連續用藥3天。對35只大鼠進行造模手術，術中術后死亡6只，24只大鼠造模成功。10只進行假手術，術中死亡2只。

1.4 實驗分組及給藥

術后第二天，對存活大鼠行心電圖檢查，觀察并計數大鼠心電圖Ⅰ導聯、aVL導聯及V1-V6導聯中的病理性Q波，病理性Q波計數在5個以上視為造模成功[7]。獲得24只心梗大鼠進行隨機分配，將其分別分配到模型組、培哚普利組及益氣活血組，每組8只。并利用8只假手術大鼠作為對照組。術后第二天進行給藥，連續灌胃給藥28天。給藥劑量按照臨床等效劑量進行換算，其中益氣活血組每天給藥8.2 g/(kg·d)、培哚普利組每天給藥劑量0.4 mg/(kg·d)。假手術組和模型組每天給予等量蒸餾水灌胃。

1.5 指標檢測

1.5.1 超聲心動檢測大鼠左室功能 給藥28天后，對各組大鼠左心室功能進行超聲心動檢測，觀察藥物對左室功能的影響。檢測時利用高頻探頭RMV716進行定位，通過M模式對心室功能分析評價，采集3個連續的心動周期取平均值。主要檢測指標包括左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5.2 大鼠血液和心肌組織取材 超聲結束后，對大鼠進行腹主動脈取血，然后進行心臟組織取材。血液樣本4℃狀態下自然沉淀凝固30分鐘，3000 r/min離心15分鐘，取上清-80℃保存用于酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)；心肌組織一部分4%多聚甲醛溶液固定處理后用于石蠟包埋切片，其余部分分離梗死邊緣區，-80℃保存用于蛋白免疫印跡檢測(Western Blot，WB)。

1.5.3 蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色) 4%多聚甲醛固定心肌組織，進行包埋切片并進行HE染色，全景掃描顯微鏡下觀察病理切片并采集圖像。

1.5.4 WB檢測TLR4、NF-κB蛋白表達 取梗死邊緣區組織50 mg在RIPA裂解液中充分裂解、勻漿，4℃離心取上清后采用BCA法進行蛋白定量，SDS-PAGE蛋白質電泳，PVDF轉膜，室溫封閉及一抗二抗孵育后曝光，最后對膠片進行掃描后Quantity One圖像分析軟件對蛋白條帶進行光密度值分析，β-actin作為內參。TLR4、NF-κB的相對表達量利用TLR4、NF-κB條帶與β-actin的光密度值的比值表示。觀察給藥28天后各組心梗大鼠梗死邊緣區心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達及藥物影響。

1.5.5 ELISA檢測TNF-α、MCP-1、IL-6含量 ELISA法測定血清TNF-α、MCP-1、IL-6的變化，依據試劑盒說明進行操作。觀察給藥28天后各組心梗大鼠血清中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6含量變化及藥物影響。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠左室功能比較

給藥28天后，超聲心動圖檢測各組大鼠左室功能。模型組較假手術組：LVIDd、LVIDs均顯著升高(P<0.05)，LVEF、LVFS均顯著降低(P<0.05)；給藥組較模型組：LVIDs顯著性降低(P<0.05)、LVEF、LVFS均顯著性升高(P<0.05)、LVIDd無明顯變化；益氣活血組與培哚普利組比較： LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS，各指標變化均無統計學差異。見表1。

表1 給藥28天后各組心梗大鼠左心室功能變化

2.2 各組大鼠梗死邊緣區心肌組織HE染色結果

給藥28天后，梗死邊緣區HE染色發現：假手術組心肌纖維排列規整，結構清晰，細胞形態無明顯改變，少見炎性細胞侵潤；模型組心肌纖維排列散亂，結構模糊，細胞形態明顯改變、呈現不規則形狀，間隙明顯增寬，細胞核游移散亂，細胞間質出現大量炎性細胞浸潤；培哚普利組和益氣活血組心肌纖維排列較為規整，結構清晰，細胞形態較為規則，細胞間隙稍有增寬，可見部分炎性細胞浸潤。見圖1。

注：A:假手術組；B:模型組；C:培哚普利組；D:益氣活血藥組

2.3 各組大鼠梗死邊緣區心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達情況

給藥28天后，檢測各組梗死邊緣區心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達情況，結果顯示：模型組中TLR4、NF-κB蛋白表達較假手術組顯著性升高(P<0.05)；培哚普利組和益氣活血組中TLR4、NF-κB蛋白表達較模型組顯著性降低(P<0.05)；給藥組組間，TLR4、NF-κB蛋白表達情況無統計學差異。見表2，圖2。

表2 各組大鼠梗死邊緣區TLR4、NF-κB蛋白表達結果

注：A:假手術組; B:模型組; C:培哚普利組; D:益氣活血藥組

2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量變化

給藥28天后，檢測各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量，結果顯示：模型組血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量較假手術組顯著性升高(P<0.05)；培哚普利組和益氣活血藥組血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量較模型組顯著性降低(P<0.05)；在用藥組間，血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量變化無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、MCP-1及IL-6含量變化

3 討論

中醫認為心主血脈，脈為血府，以氣為本。MI在中醫上屬于“胸痹”“真心痛”范疇，病機多屬“本虛標實”，陽虛、氣虛為本，血瘀為標[8]。針對氣虛血瘀的病機，臨床上多采用益氣活血的組方進行治療。本研究中益氣活血藥以黃芪、當歸、生曬參、川芎、三七等藥進行配伍組方，發揮益氣活血、通補兼施的功效，對MI氣虛血瘀證具有重要的應用價值。前期研究發現，益氣活血藥通過調節MI后心室重構、心肌纖維化及心肌細胞凋亡[9-11]對心室功能發揮保護作用。

TLR4/NF-κB信號通路介導的慢性炎癥反應在多種疾病的進程中起到重要的調節作用。作為經典的炎癥調節通路，在MI的相關研究中，TLR4/NF-κB通過調節炎癥因子的表達介導心肌炎癥損傷和心肌重塑，這些炎癥因子包括TNF-α、MCP-1及IL-6等[12-14]。在對MI后心力衰竭的相關研究中發現通過抑制TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應，能夠改善心肌缺血后心室功能的進展性障礙，降低心力衰竭的風險[15-16]。Yang等[17]利用分離出的紫草素作用心臟損傷模型，發現其通過抑制膠原聚集、TLR4/NF-κB等途徑，顯著改善心肌損傷后的心功能，減少心肌纖維化、抑制炎癥、減輕細胞凋亡和內質網應激，緩解體內心力衰竭。HU等[18]通過敲除小鼠TLR4基因研究高脂飲食所致的心功能不全，發現炎癥反應在其中起重要作用，TLR4基因敲除可能通過NF-κB/JNK調節自噬，抑制炎癥和活性氧自由基，改善心肌收縮功能和Ca2+異常，減輕心肌重塑和收縮功能障礙的發生和發展。

本研究基于TLR4/NF-κB信號通路，從炎癥反應的角度出發，研究益氣活血藥對MI后心室功能的調節作用。研究結果表明，益氣活血藥能夠顯著改善心梗大鼠左室功能，抑制TLR4、NF-κB蛋白在梗死邊緣區心肌組織中的表達，降低心梗大鼠血清組織中TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子的含量，減輕心梗大鼠MI后持續的炎癥反應。提示益氣活血藥可能通過TLR4/NF-κB信號通路，抑制心梗大鼠的炎癥反應，阻止心室功能的進展性障礙，從而發揮保護心梗大鼠心室功能的作用。

綜上所述，心室功能的進展性障礙作為影響MI預后的重要因素，研究其病理基礎和藥物對其進行防治的作用機制具有重要意義。益氣活血藥在阻止MI后心室功能的進展性障礙方面能夠發揮重要的作用，TLR4/NF-κB信號通路作為潛在的作用途徑，可能通過抑制慢性炎癥反應保護心臟功能。