全二維氣相色譜-飛行時間質譜解析清香型汾酒揮發性組分特征

楊 波，張 鑫，王鳳仙，高曉娟，樊杉杉，陳 雙，徐 巖

(1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽 032205；2.江南大學生物工程學院釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇無錫 214122)

白酒是一種享譽世界的蒸餾酒，尤其在我國酒文化中占有重要地位。清香型汾酒作為“清香型鼻祖”“中國酒魂”是我國具代表性的白酒品種之一，其釀造工藝可追溯到距今1500 年的南北朝時期。汾酒嚴謹科學的釀造工藝成就了其卓越的品質特性，受到市場消費者的廣泛青睞[1]。

揮發性成分是影響白酒風味品質和生理活性的重要因素。2007 年開始的“中國白酒163 計劃”的重要組成部分“中國清香型汾酒風味物質剖析技術體系及其關鍵風味物質研究”中，首次應用液液萃取結合正相色譜技術，運用氣相色譜結合質譜（GCMS）等分析檢測汾酒的揮發性組分達703 種[2]。這些研究豐富了對清香型白酒風味化學組分的認識。但由于研究方法的限制，目前對清香型白酒揮發性組分的認識還落后于其他香型白酒。

目前白酒中揮發性組分的研究一般采用GCMS 技術。但由于白酒中揮發性組分組成的復雜性，傳統的一維色譜分離技術由于峰容量有限，已經無法滿足白酒復雜組分的分析要求。全二維色譜技術（GC×GC）是最近20年新開發出的一種全新的色譜分離技術，采用連續調制的方式將第一維色譜柱中分離的組分全部轉移至第二維色譜柱中進行進一步分離，其具有高分辨率、高靈敏度、高峰容量等優勢，是當前能夠實現的最高分辨率的色譜分離技術[3]。相對于一維色譜幾十到100 種組分的分離能力，全二維色譜技術能夠在酒精飲料中一次性實現幾百到上千種組分的有效分離。與傳統的質譜檢測器相比，飛行時間質譜（TOF-MS）掃描范圍寬，分析速度快，靈敏度高。因此GC×GC-TOFMS將是實現復雜樣品揮發性組分分離鑒定的有力工具。因此本研究采用該方法對清香型白酒的揮發性組分進行解析，并對潛在香氣組分和生理活性組分進行篩選，進一步加強了對清香型白酒揮發性組分的認識。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

本研究所用汾酒樣品是由山西杏花村汾酒集團有限責任公司提供的汾酒典型酒樣。

1.1.2 試劑及耗材

二氯甲烷（色譜純，百靈威科技有限公司），戊烷、甲醇（色譜純，百靈威科技有限公司），無水乙醇（色譜純，上海安譜科學儀器公司），乙醚（分析純，使用前重蒸，上海國藥集團），無水硫酸鈉（Na2SO4，分析純，上海國藥集團），氯化鈉（NaCl，分析純，上海國藥集團），超純硅膠（400 目，上海安譜科學儀器公司），2 mol/L 硫酸（H2SO4）溶液，0.1 mol/L 標準氫氧化鈉（NaOH）溶液。實驗用水均為煮沸5 min后冷卻至室溫的超純水。

1.1.3 儀器設備

頂空固相微萃取多功能自動進樣系統（MPS2），德國Gerstel 公司；全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀（GC×GC-TOFMS，Pegasus 4D），美國LECO 公司；7890B 氣相色譜儀，美國安捷倫公司；玻璃色譜柱（30 cm×1.5 cm）；DC-12 氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；Millipore-Q超純水系統，美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃?。℉S-SPME）提取汾酒中揮發性組分

參照本實驗室前期優化的方法[1]，取10 mL 稀釋至10%vol 的酒樣置于20 mL 頂空瓶中，加入3 g NaCl 至飽和，使用帶特氟龍墊片鋁蓋密封。通過MPS2 進行HS-SPME 操作，使用2 cm 的50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭進行萃取，首先在50 ℃下平衡5 min，萃取45 min，轉速為400 r/min。萃取完成后進行GC×GC-TOFMS 檢測分析，將萃取頭置于250 ℃的GC進樣口下吸附5 min。

1.2.2 液液萃?。↙LE）結合正相色譜分離提取汾酒樣品中揮發性組分

參照Zhao 等[4]方法，取500 mL 酒樣加入NaCl至飽和，用二氯甲烷在分液漏斗中萃取3次（50 mL×3），合并有機相記為萃取相Ⅰ。加150 mL 超純水到萃取相Ⅰ中，再用配制好的10 % NaOH 溶液調節pH 值至9，用分液漏斗分層，有機相記為萃取相Ⅲ（中堿性組分NBF），上層水相記為萃取相Ⅱ。隨后用2 mol/L 的H2SO4溶液調萃取相Ⅱ的pH 值為2，用二氯甲烷在分液漏斗中萃取3 次（25 mL×3），合并有機相得到萃取組分Ⅵ（酸性組分AF）。NBF、AF 均加入適量的無水Na2SO4（呈流沙狀即可）置于-20 ℃下干燥過夜，氮吹濃縮至500 μL。

參照Fan 等[5]方法，進一步采用正相色譜技術將“NBF”預分離，以降低后續分析的干擾性和復雜性。分離使用手工填充硅膠的30 cm×1.5 cm 直徑玻璃色譜柱。上樣前依次使用50 mL 甲醇、二氯甲烷、乙醚、戊烷洗脫活化硅膠色譜柱。活化完成后，將500 μL“NBF”濃縮液注入硅膠色譜柱，采用不同濃度比例的洗脫劑進行揮發性組分預分離。初始洗脫溶劑為100%戊烷，然后逐步提高乙醚比例以增強洗脫極性，再使用100%二氯甲烷、100%甲醇進一步提高洗脫極性。每個梯度收集1 個組分，整個分離過程共收集11 個不同的洗脫組分。將這11個不同組分進行感官分析后，分別濃縮至500 μL，稱作“F1—F11”。

1.2.3 GC×GC-TOFMS解析揮發性組分

氣相色譜為安捷倫7890B (Agilent，美國)，第一維色譜柱為DB-FFAP毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent，美國），第二維色譜柱為Rx-17 Si毛細管柱（0.8 m×0.25 mm×0.36 μm，Restek，美國）。一維色譜柱和二維色譜柱之間通過四噴口雙級熱調制器串聯，傳輸溫度為240 ℃。以He 作為載氣，流速1 mL/min，進樣口溫度為250 ℃。一維色譜柱升溫程序為：初始溫度45 ℃保持3 min，4 ℃/min 升溫至150 ℃保持2 min，6 ℃/min 升溫至200 ℃后再以10 ℃/min 升溫至230 ℃并保持10 min。二維色譜柱的溫度設置全程比一維色譜柱高5 ℃。調制補償溫度為20 ℃，調制周期為4 s，熱脈沖時間為0.8 s。

離子源電壓70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度240 ℃，離子掃描范圍35～400 amu，掃描頻率100 spestra/s。

1.2.4 化合物鑒定

實驗采集的TOFMS 數據由LECO 公司ChromaTOF?工作站進行數據處理，自動識別信噪比大于50 的色譜峰后進行自動積分解卷積和質譜庫比對。譜庫比對通過兩種方式進行，一方面使用的譜庫為江南大學釀造微生物與應用酶學實驗室自建的白酒揮發性風味數據庫（包含近3000 種白酒中揮發性組分），比對結果自動生成“峰表”，去除重復信息獲得酒樣的定性結果。另一方面比對質譜庫為NIST 14 和Wiley 9，所有比對結果自動生成“峰表”?！胺灞怼苯涍^進一步人工解譜及同系物二維色譜出峰規律比對驗證后作為初步鑒定結果。最后剔除烷烴類等沒有風味貢獻的化合物，選擇相似度大于800，反相似度大于800，可能性大于4000 的化合物進行后續鑒定分析。將每個化合物儀器給出的保留指數與NIST 網站中報道的相同色譜柱下的保留指數進行比對，篩選差值在-50～50 的化合物作為鑒定結果。將兩種比對方法獲得結果整合后形成最終的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 清香型白酒中揮發性組分的鑒定

揮發性組分是構成白酒風味和功能的物質基礎[6]，目前白酒中已經檢測到的揮發性組分達3000種，其構成極其復雜。由于不同物質有著不同的極性、溶解性、揮發性、熱穩定性等性質，因此，不存在一種前處理方法能夠提取出白酒中所有的揮發性組分[8]。本研究采用HS-SPME 與LLE 相結合，有利于揮發性組分的提??；同時為了減少儀器分析的復雜性，進一步將LLE 后的濃縮液分為AF 與硅膠柱過柱后的F1—F11。實驗室感官分析PANEL 小組對11 個組分進行感官分析（表1）表明不同組分間具有顯著的香氣差異。F1 和F2 呈現溶劑香，隨洗脫極性提高，F3—F4 逐漸呈現出果香和植物的香氣特征，隨著洗脫極性進一步增強，F5 和F6 呈現出皮革的刺激氣味，F7—F11 具有焦糖、煙熏、調味品等香氣特征。

表1 清香型白酒預分離組分感官特征分析

為了全面解析清香型白酒的揮發性組分，采用分辨率高，靈敏度高，峰容量大的GC×GC-TOFMS系統分析鑒定了所有汾酒組分中含有的揮發性化合物，圖1 為經HS-SPME 前處理的二維總離子流色譜圖，結果顯示，汾酒中揮發性組分色譜峰十分復雜。由圖2 可以看出，乙酸苯乙酯與β-大馬酮在一維色譜柱上共流出（2096 s），通過第二根色譜柱這兩個化合物實現了很好的分離。因此，共流出組分之間的干擾得到了有效降低，GC×GC 可以檢測到更多的色譜峰。

圖1 清香型白酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析二維總離子流色譜圖

圖2 清香型白酒中發現的2個調制峰

通過GC×GC-TOFMS 對所有汾酒組分（HSSPME、AF、F1—F11）進行檢測，共獲得13 張二維色譜圖。大量色譜峰的檢出，對化合物的鑒定提出了巨大的挑戰，傳統一維氣相色譜質譜色譜峰逐一鑒定方法難以實現。本研究采用以下策略對譜圖中的化合物進行鑒定分析：首先通過Leco Pegasus 4D 色譜分析工作站結合本實驗室建立的包含2959個揮發性組分的中國白酒揮發性組分數據庫檢索分析，獲得初步鑒定結果。由于本研究對汾酒揮發性組分進行了充分的預分離，再通過GC×GCTOFMS 進行揮發性組分檢測，會鑒定出更多的揮發性組分，因此為了進一步補充中國白酒揮發性組分數據庫，通過Leco Pegasus 4D色譜分析工作站結合mainlib 譜庫、replib 譜庫、nist 譜庫以及wiley 譜庫的自動解卷積和檢索分析，選擇相似度大于800，反相似度大于800，可能性大于4000 的化合物，剔除柱流失和烷烴類等物質作為最終鑒定結果。匯總各個組分的物質鑒定結果，采用LLE前處理方式共鑒定出揮發性物質1001 種，采用HS-SPME 前處理方式共鑒定出揮發性物質602 種。將其進行整合，共從汾酒中鑒定出揮發性組分1224 種，是目前公開報道中最多的[2，9-14]，各組分鑒定結果見表2。

表2 清香型白酒各組分GC×GC-TOFMS定性結果

如表3 所示，從汾酒中檢測到酯類化合物有281 種，主要包括以乙酯為主的直鏈酯、支鏈酯、羥基酯、不飽和酯等；醛酮類化合物有228 種，主要包括直鏈脂肪醛、支鏈脂肪醛和不飽和醛等醛類，羥基/羰基酮、連二酮和環酮等酮類以及縮醛類化合物；醇類化合物有206 種，分為直鏈脂肪醇、支鏈脂肪醇、2-醇、3-醇、4-/5-醇、不飽和醇、環狀支鏈醇、含氧側鏈醇和多元醇；在汾酒中共檢測到揮發性脂肪酸88 種，分為直鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸；首次在清香型白酒中發現大量的萜烯類化合物，本次在汾酒中共檢測到86 種，主要包括萜烯、萜烯醇、萜烯醛、萜烯酮和萜烯氧化物等；檢測到芳香族化合物57 種，包括芳香烴、芳香醛、芳香縮醛、芳香酮、芳香醚、芳香醇、芳香酸和芳香酯；此外還檢測到呋喃類化合物52 種；烯烴類化合物46種；醚類化合物32 種；內酯類化合物24 種；酚類化合物19 種；吡嗪類化合物14 種；含硫化合物9 種和其他化合物106 種。在這1224 種揮發性組分中，酯類、醇類和醛酮類化合物作為汾酒中種類最多的化合物（表3），這一結果與其他白酒研究結論一致[15-16]。

表3 清香型白酒中鑒定出的揮發性組分

將清香型白酒揮發性組分與本實驗室建立的中國白酒揮發性組分數據庫中的濃香型和醬香型揮發性組分做對比。維恩圖（圖3）揭示了3 種不同香型白酒中揮發性組分的相互關系，3 種不同香型白酒中揮發性組分中有660 個化合物被共同檢出；清香型白酒與濃香型白酒共有的揮發性化合物有61 種；與醬香型白酒共有的化合物有159 種；清香型白酒獨有的揮發性化合物有344 種。該結果表明清香型白酒揮發性組分構成復雜且具有獨特的揮發性組分特征。

圖3 濃香、清香、醬香型白酒化合物種類間的關系

2.2 清香型白酒中潛在香氣活性組分的確定

為了確認上述檢測到的1224 種揮發性組分是否具有香氣貢獻，共檢索了50 篇關于白酒風味的SCI 論文和100 篇中文文章，同時查閱了相關網站如Flavornet、Flavor DB 等，結果表明，共有358 種化合物具有香氣貢獻，為清香型白酒中的潛在香氣活性組分，包括酯類香氣化合物72 種，醇類香氣化合物49 種，醛酮類香氣化合物71 種，有機酸類香氣化合物19 種，芳香族香氣化合物40 種，酚類香氣化合物9 種，呋喃類香氣化合物12 種，吡嗪類香氣化合物12 種，含硫香氣化合物10 種，萜烯類香氣化合物37 種，內酯類香氣化合物13 個，其他香氣化合物14種，表4 列出了部分香氣化合物的物質信息。根據鑒定化合物的香氣特征和物質結構，將具有相同或相似香氣特征的香氣活性成分歸類整理形成如圖4 所示的清香型白酒香氣化合物分類圖，結果表明，鑒定的香氣活性成分主要可以分成水果香、青香、酸、溶劑、奶油、木香、烘烤、煮蔬菜、煙熏、花香，清香型白酒整體香氣特征是由多種香氣活性成分共同作用形成的復合香氣。且目前清香型白酒國標已將優級酒的香氣描述由原來的“清香純正，具有以乙酸乙酯為主體的清雅、協調的復合香氣[17]”更改為“清香純正，具有糧香、曲香、蜜香、醇香、焙烤香、糟香、果香、花香、芳草香等一種或多種復合自然香氣”。本研究可為清香型白酒國標修訂提供理論支持。

圖4 清香型白酒香氣化合物分類及部分化合物結構式

通過與前期清香型白酒香氣特征研究比較發現186 個在清香型白酒中未曾報道過的香氣化合物[1，18-21]，如圖5 所示，包括酯類29 種，醇類25 種，酸類5種，醛類28種，酮類14 種，芳香族14 種，呋喃類12 種，吡嗪類5 種，含硫化合物7 種，內酯類11 種，萜烯類30 種和其他類6 種。酯類化合物是白酒中最豐富且最重要的一類香氣化合物，主要呈現果香和花香，給清香型白酒帶來水果、清甜的香氣特征。酯類物質一般是在發酵過程中在相關酶的催化作用下，?；o酶A 及脂肪酸和醇類反應生成[22]。醇類物質是清香型白酒中含量最多的香氣化合物，香氣描述大都是醇香、果香，是在酒精發酵過程中由酵母等微生物作用于淀粉、氨基酸等轉化而成[23]。羰基化合物主要包括醛類和酮，主要呈現青香、黃瓜等清新的香氣和奶油等甜香。白酒中的醛類物質是由同碳數的醇或相對應的醇氧化而成的，酮類物質是由同碳數的醛或相對應的醛氧化而成的。酒中的酸類化合物大部分是在發酵過程中由酵母代謝生成，其次來自原料、酒曲以及醇、醛氧化而來，這些酸所呈現出來的是酸味、汗臭味或奶酪味，不屬于怡人的香氣，但酸類物質是酒精飲料中不可或缺的重要協調成分和呈味物質[24]。芳香族化合物主要來自于原料中單寧、木質素、阿魏酸、香草醛等經酵母和細菌的發酵形成，可使酒體香味更加濃郁協調[25]。為進一步深入研究清香型白酒風味特色奠定了基礎，對生產實踐具有一定的指導意義。

圖5 清香型白酒新發現的香氣化合物分類情況

對這186 個新發現的香氣物質進行閾值的查詢[26]，發現53種香氣化合物在水中或酒精水溶液中的閾值低于500 μg/L，可能是清香型白酒中存在的潛在重要香氣化合物（見表4）。其中2-壬醇（黃瓜；82 μg/L）、香茅醇（玫瑰；100 μg/L）、2-己烯醛（腐爛，腐臭；30 μg/L）、2-辛烯醛（青香；0.2 μg/L）在葡萄酒中具有風味貢獻（OAV＞1），且其含量隨著葡萄酒儲存時間的增加具有一定的變化[27]。反式-2-辛烯-1-醇（肥皂，塑料；40 μg/L）、3-辛酮（藥草，黃油，樹脂；23 μg/L）為葡萄酒中所關注的異嗅味[28]。茶香酮[29]（甜木香，茶香，煙草；25 μg/L）被鑒定為來自杜羅地區的葡萄牙葡萄酒中甜香描述符的化合物之一。有研究表明，戊醛（杏仁，麥芽，辛辣；100 μg/L）可以作為區別不同地區朗姆酒的標記物[30]。反,順-2,6-壬二烯醛（黃瓜，蠟，青香；0.3 μg/L）在威士忌中具有香氣貢獻（OAV=3）[31]。乙酸-3-苯丙酯（辛料，鮮花；100 μg/L）為番石榴酒的香氣活性成分（OAV=3）[32]。此外，還發現一些目前白酒中關注度較高的含硫化合物、吡嗪和內酯類化合物，如2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（土豆；0.04 μg/L），甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫（熟肉，硫胺；0.3 μg/L），2-乙酰基噻唑（爆米花，面包，果仁；10 μg/L），γ-庚內酯（堅果，脂肪，水果；400 μg/L），δ-癸內酯（椰子；410 μg/L），順式-4-羥基-7-十二烯酸內酯（桃子，甜蜜；250 μg/L），δ-十二內酯（水果，甜；98 μg/L）。這些潛在重要香氣活性組分的鑒定將有助于確認清香型白酒的特征風味物質，進而揭示清香型白酒的關鍵風味物質和本質特征。

表4 清香型白酒中新發現的重要香氣化合物

2.3 清香型白酒中健康功能組分的確定

近年來，健康白酒成為中國白酒發展的新趨勢。白酒生物活性因子的研究目前受到了廣泛關注。本研究通過查閱文獻（150篇）的方式對汾酒中鑒定出的揮發性組分進行健康功能組分的篩選，最終確定出241 種健康功能組分（見圖6），包括萜烯類75 種，呋喃類52 種，低分子有機酸及其酯24 種，內酯類24 種，酚類22 種，高級脂肪酸及其酯18 種，吡嗪類14 種，其他類12 種。清香型白酒中的萜烯物質種類豐富，所有的萜烯類化合物主要包括萜烯、萜烯醇、萜烯醛、萜烯酮、萜烯氧化物和萜烯酯類化合物。這些萜烯類化合物除了具有風味貢獻外，還具有鎮痛、抗菌、抗病毒[33]、抗氧化[34]、抗癌[35]等生理學功能，如樟腦、4-萜烯醇、異佛爾酮、γ-古蕓烯、茴香腦、欖香烯和β-桉葉油醇、α-姜黃烯和α-杜松醇等。清香型白酒中的低分子有機酸和高級脂肪酸及乙酯對人體健康有良好的功效，如乙酸具有殺菌抗病毒、擴張血管、延緩血管硬化等功效；很多脂肪酸能抑制膽固酵的合成；亞油酸乙酯具有降低膽固醇和血脂的作用，可以防治動脈粥樣硬化癥[36]。研究表明，多數內酯類物質是人體健康功能性成分，如當歸內酯，它可通過不同途徑拮抗化學因素引發的免疫抑制作用，是一種新的生物反應免疫調節劑[37]。白酒中的許多酚類物質對人體具有保健作用，如4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚和阿魏酸等化合物經研究具有抗氧化的功能[38]；丁香酚具有抗菌健胃的作用[39]。吡嗪類化合物是指苯環的1，4 位含兩個雜氮原子的雜環化合物，其廣泛存在于天然或加工后的食品中，是白酒中最重要的香氣成分之一，同時也是重要的生理活性成分。如2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪等均具有抗氧化功能[40]，而四甲基吡嗪則是白酒中最為主要的吡嗪物質，是中藥川芎的主要有效成分，是活血行氣祛瘀的一種中藥活性生物堿。本研究證明清香型白酒中存在多種與人體健康密切相關的生理活性物質成分，對于今后深入探究清香型白酒與人體健康關系具有一定的指導意義。

圖6 清香型白酒健康功能組分分類及部分結構式

3 結論

本研究應用GC×GC-TOFMS 結合HS-SPME、LLE 及正相色譜分離，首次全面解析了清香型白酒中的揮發性組分，清香型白酒富含1224 種揮發性化合物，進一步挖掘出358 種香氣化合物，這些物質共同構成了清香型白酒清香純正，具有糧香、曲香、蜜香、醇香、焙烤香、糟香、果香、花香、芳草香等一種或多種復合自然香氣的特征；同時鑒定出清香型白酒中含有241 種健康功能組分，為健康飲酒提供科學依據，為弘揚白酒的健康文化，促進健康白酒事業的蓬勃發展提供參考。