β-catenin和DKK1在皮膚惡性黑色素瘤中的表達及其 與預后的關系

周雨馨，龐得全，田菲，韓朵，石書瑋

(河北省唐山市華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000)

0 引言

惡性黑色素瘤發病隱匿，惡性程度高，發生血行轉移或淋巴結轉移早，預后極差。大量的臨床研究資料證實，約占50%的MM最終死于遠處轉移。據統計，90%的MM發生于周身皮膚。皮膚惡性黑色素瘤(Cutaneous malignant melanoma，CMM)是一種神經嵴黑色素細胞來源的惡性腫瘤，是致死性最大的皮膚腫瘤[1]。目前，對于早期的惡性黑色素瘤多采用手術切除，術后根據其病情發展可選擇放、化療，但該疾病早期轉移率高，單純放、化療敏感性較差，療效一般。隨著對黑色素瘤分子生物學的深入研究，黑色素瘤轉化的主要細胞通路在于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路、酪氨酸激酶受體(TKR)途徑等，科學家們針對黑色素瘤的不同作用靶點研制出一系列抗腫瘤藥物用于其治療[2]。時至今日，靶向藥物已進入臨床應用，而針對 β-catenin及DKK1基因的研究仍處于機制探索階段，兩者在 CMM中的聯合研究在文獻中少有報道。因此，本研究就天津醫科大學附屬腫瘤醫院五年的 MM 收治情況和預后相關因素進行分析探討，然后進一步探索β-catenin、DKK1在皮膚惡性黑色素瘤中的表達情況及與預后的關系，為進一步認識 CMM 的預后因素、探討基于分子水平的發病機制、協同機制和促進分子靶向藥物研發等起到一定的促進作用。

1 資料與方法

1.1 患者資料

回顧性分析2005年1月至2009年12月在在天津醫科大學附屬腫瘤醫院確診并治療的190例MM患者病歷資料。從中篩選出經組織病理學確診為CMM且術前均未有手術治療、化學治療、放射治療和免疫治療史的患者共30例。(1)初選切片：隨機收集病例庫中CMM病理切片30例納入CMM組，瘤周相應正常皮膚組織30例作為對照組。(2)排除標準：結合HE和免疫組織化學染色情況，剔除切片中無瘤組織、破碎瘤組織、CMM轉移淋巴結組織、染色過程中脫片等無效切片，剔除病歷隨訪中死于其他疾病的無效切片。

1.2 染色

對所選切片進行HE染色和免疫組化SP兩步染色法。

1.3 判定

β-catenin采用半定量檢測法[4]，DKK1采用Volm雙評分法[5]。根據陽性細胞在全部癌細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度判定實驗結果：

DKK1基因表達在免疫組織化學染色中主要以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性判定標準，β-catenin基因表達在免疫組織化學染色中主要以細胞漿或細胞核出現棕黃色顆粒為陽性判定標準。首先根據著色的程度將表達強度分為：0分：無著色；1分：淺黃色：2分：棕黃色；3分：棕褐色。根據著色的細胞比例分別分為：DKK1：1分：≤25%；25%<2分≤50%；3分：>50%。β-catenin：0分：無陽性；1分：<10%；10≤2分≤50%；3分：>50%。β-catenin的表達情況以著色程度值與著色細胞比例值的乘積為結果，0分為陰性，≥1分為陽性；DKK1的表達以著色程度值與著色細胞比例值之和作為最終結果。

1.4 統計學方法

首先對全部 30 例患者進行一般情況分析，然后對納入統計分析的各組患者進一步分析：Chi-Square Test 進行 CMM 組和對照組間基因表達差異分析，Spearman秩相關進行各基因之間及各基因與淋巴結轉移之間的相關性分析，Kaplan-Meier法Log-Rank 檢驗進行基因表達的單因素生存分析，均以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

回顧性分析5年來天津醫科大學附屬腫瘤醫院納入統計分析的190例患者中總中位生存時間為43.1個月。30名CMM患者的一般特征見表1。男女比1.14∶1。初診年齡40～90歲，中位發病年齡56歲。50歲以后發病居多，超過65歲的患者約占30%。發病部位以肢端(手足部)居多。

表1 30 例 CMM 患者的一般特征(n,%)

2.2 表達情況

(1)CMM組中β-catenin陽性表達15例，陽性率68.2%；對照組中陽性表達4例，陽性率18.2%，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。(2)CMM組中DKK1陽性表達17例，陽性率68.0%；對照組中陽性表達5例，陽性率20.0%，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 β-catenin、DKK1 在 CMM 組和對照組中的表達情況比較(n,%)

2.3 關系分析

(1)與CMM預后的關系分析：CMM組中β-catenin陽性表達15例，陽性率68.2%。單因素生存分析顯示β-catenin的表達可影響CMM的預后(P<0.05)；CMM組中DKK1陽性表達17例，陽性率68.0%。單因素生存分析顯示DKK1的表達不是CMM的預后影響因素(P>0.05)，詳見表3。(2)與淋巴結轉移的關系分析：CMM組(β-catenin切片組)中有淋巴結轉移10例，其中9例β-catenin表達陽性，陽性率90.0%；無淋巴結轉移12例，其中有6例β-catenin表達陽性，陽性率為50.0%；差異具有統計學意義，呈正相關(r=0.428，P<0.05)；CMM組(DKK1切片組)中有淋巴結轉移9例，全部9例DKK1的表達均為陽性，陽性率100%；無淋巴結轉移16例，其中8例DKK1表達陽性，陽性率50.0%；差異具有統計學意義，呈正相關(r=0.514，P<0.05)。詳見表4。

表3 β-catenin、DKK1 的表達差異與CMM 的預后關系

表4 β-catenin、DKK1 的表達差異與淋巴結轉移的相關性分析(n,%)

2.4 β-catenin、DKK1的表達之間的相關性分析

CMM組β-catenin表達陽性的14例切片中，有10例DKK1也表達陽性。β-catenin表達陰性的7例切片中，有1例DKK1也表達陰性。β-catenin與DKK1的表達一致性52.4%(11/21)，差異無統計學意義(r=-0.158，P>0.05)，詳見表5。

表5 β-catenin 與DKK1 表達之間的相關性分析

3 討論

惡性黑色素瘤惡性程度極高，在疾病早期容易發生淋巴結及血行轉移，臨床預后差，晚期患者中位生存期僅為7.5個月，2年生存率約為15%，5年生存率僅為5%[4]。黑色素瘤由神經鞘細胞癌變發展而來，而神經鞘細胞來源于外胚層，因此惡性黑色素瘤主要發生于皮膚[5]。對于晚期惡性黑色素瘤，50%～80%的患者可出現肝轉移，8%～46%的患者可出現腦轉移[6]。與很多惡性腫瘤一樣，部分早期MM患者可通過手術得到根治，化療、放療及生物治療都是中晚期MM患者的傳統治療手段，但MM對上述治療措施均不敏感。而隨著對黑色素瘤機制研究的不斷深入及現代生物技術的不斷發展，腫瘤免疫治療為改善患者預后帶來新希望[7]。學者們在惡性腫瘤中研究的最多是Wnt/β-catenin信號通路，常被稱為經典Wnt信號通路[8]。持續異常激活經典Wnt信號通路時可通過增加β-catenin下游靶基因的表達實現增加血供、抑制凋亡、加速增殖、促進轉移的惡性結果，腫瘤易感性大大增加。DKK1在惡性腫瘤中的研究非常少，目前被認為是經典Wnt信號通路的傳統抑制劑。分子靶向藥物逐漸正承擔起愈發重要的角色。

β-連環蛋白(β-catenin)由β連環蛋白1(cateninbeta1，CTNNB1)基因編碼，是一種高保守的多功能分泌型蛋白，參與構成WNT/β-catenin信號通路發揮作用[11]。β-catenin是WNT/β-catenin重要的節點，可通過與鈣黏蛋白作用參與細胞間黏附。研究表明β-catenin表達可下調鈣黏蛋白水平，因此β-catenin異常表達會造成細胞間黏附作用減小、松散，進而提高腫瘤轉移風險[9]。本研究發現，CMM組織中β-catenin陽性表達率明顯高于癌旁組織，β-catenin表達與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移均呈正相關，正常細胞間黏附作用較強，從而實現信息交流和物質交換，而腫瘤細胞則相反，通過減弱細胞間黏附作用實現細胞脫落，然后發生惡性增殖和轉移，可能原因是β-catenin過表達會降低鈣黏蛋白水平，從而降低細胞間黏附作用，增加腫瘤細胞脫落和轉移風險。這與張攀[10]等研究結果一致。此外β-catenin高表達會使WNT/β-catenin通路持續處于激活狀態，使通路中下游分子突變，促進腫瘤發生發展，因此惡性程度高、相對較大的腫瘤更易發生淋巴結轉移[11]。

作為Wnt/β-catenin信號通路中重要一環的DKK1，曾被作為經典抑制劑進行各種腫瘤的基礎研究，但現在越來越多的學者發現DKK1在不同研究條件下呈現出截然不同的結果。DKK1至少有兩種方式可關閉經典Wnt信號通路[12]，一是Frizzled相關蛋白質，通過競爭性抑制Frizzled與Wnt的結合；另一個就是DKK1，可與細胞膜上的Wnt受體LRP5/6、共受體Kremen1/2結合，形成聚合物后內吞，關閉Wnt信號，終止靶基因異常轉錄進程。此外，DKK1是經典Wnt信號通路的靶基因，其啟動子區域有β-catenin結合位點，部分研究認為轉錄生成的DKK1可以通過負反饋抑制上游基因的表達[13]，與信號鏈上其他因子共同維持著內環境的穩態。關于DKK1在惡性腫瘤中的表達，研究者其實早已發現有多樣化的特點。在肝細胞癌、肝/腎母細胞瘤、NSCLC、多發性骨髓瘤等腫瘤中DKK1多表達增高，呈現促癌基因的特征，而在CMM、胃癌中，據報道DKK1表達降低，呈現抑癌基因的特征。有學者通過細胞實驗發現[14]，黑色素細胞中高表達的DKK1與CMM組織中的低表達形成鮮明對比，通過si-RNA沉默黑色素細胞中的DKK1后，則黑色素細胞呈現高比例快速增殖能力。用Ad-DKK1腺病毒載體高效感染黑色素瘤A375細胞后[15]，高表達的DKK1明顯抑制了β-catenin的表達水平，而β-catenin的這一低水平表達在干擾DKK1的表達后明顯增高，從而推測β-catenin的表達下調受DKK1的影響，后者可抑制經典Wnt信號通路的傳導，發揮對腫瘤進程的抑制作用。本研究中，DKK1在CMM組中多呈陽性表達，差異具有統計學意義，與上述學者的結論相反。我們基于本研究結論展望：DKK1的表達差異是否因人種而異；大樣本數據中DKK1與淋巴結轉移及CMM預后的相關關系如何；DKK1作為傳統Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑為什么在一些研究中未發揮抑制劑的作用，除了已發現的β-catenin基因變異，是否存在或存在什么樣的干擾因素，我們的研究樣本中是否存在有統計意義的β-catenin基因變異？未來需擴大樣本量、多區域、多種族、對臨床病理因素細分后進一步研究。