二代測序在顱內感染患者中的臨床應用分析

周睿姣，廖品文

(川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000)

0 引言

中樞神經系統(central nervous system CNS)感染性疾病是病原微生物侵犯中樞神經系統的實質、被膜及血管等引起的急性或慢性炎癥性(或非炎癥性)疾病，屬于神經系統疾病中較常見較危重的一類疾病[1]。人類CNS感染的病原微生物包括病毒、細菌、結核分枝桿菌、真菌、螺旋體、寄生蟲、朊蛋白等，具有各年齡段均可累及，發病率高、病情進展迅速、致殘致死率高等特點。早期盡快進行病因學診斷、明確具體病原微生物類型對疾病的治療及改善患者預后有至關重要的作用[2]。患者的癥狀體征、病程特點、常規實驗室檢查及影像學檢查對疾病的診斷均有重要價值，但實驗室檢驗中的必選項-腦脊液培養是細菌性CNS感染的診斷金標準，但細菌培養周期長，且檢出率低下，難以滿足臨床需求，僅依靠這些方法明確顱內感染病原學診斷往往比較困難而且確診率較低，因此顱內感染的臨床診斷缺乏直接高效率的實驗室證據支持[3]。基于此，CNS感染疾病治療多以經驗性抗感染治療為主，因對病原菌種類推斷不準確，往往導致初治失敗情況，導致病情惡化、延誤治療，甚至造成患者死亡的危險。

近年來，二代基因測序技術(next-generation sequencing，NGS)作為一種病原學檢測新方法在臨床上應用越來越廣泛，其基于高通量、無偏倚，可以同時測定幾百萬條DNA 的序列，實現快速的全基因組測序的分子診斷技術能快速檢測并明確中樞神經系統感染的病原微生物[4,5]。NGS可以直接從患者病變腦組織、腦脊液甚至尿液中獲取病原微生物信息，檢測周期短，信息準確率高，是一種非常有應用前景的病原學檢測方法。克服了傳統的針對性診斷方法的局限性。理論上，幾乎所有的微生物都可以基于特定的核酸序列進行唯一鑒定，所以NGS 對于復雜、少見病原菌感染及新型致病微生物的檢出存在明顯優勢。在CNS感染早期盡快進行NGS檢測具有以下優勢：一方面利于疾病的及時確診和治療；其次，目前關于NGS 在CNS 感染中的應用個案報道非常普遍，但仍缺乏大樣本的規模研究[6]。

本研究回顧性分析川北醫學院附屬醫院神經內科2020年6月1日至2021年7月31日收治的69名顱內感染患者送檢的mNGS的檢測結果進行分析，了解顱內感染患者的病原菌分布情況，患者的住院天數及出院時情況，并與傳統病原菌檢測方法相比較，以期為NGS的臨床應用價值提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 入組標準

收集2020年6月1日至2021年7月31日川北醫學院附屬醫院神經內科收治的顱內感染患者病例,腦脊液二代測序入組標準符合《北京腦炎協作組腦炎診斷標準》[8]。排除標準包括：年齡≤28 d；腦脊液細胞學證實腦膜惡性腫瘤；損傷所致明顯血性腦脊液；已經確診自身免疫性腦炎的病例；其他器官疾病嚴重有生命危險的病例；HIV、梅毒感染或者拒絕簽署知情同意書。最終共69例感染性腦炎/腦膜炎/腦膜腦炎患者入組，其中女性患者40例，男性患者29例;年齡最小者為22歲，年齡最大者為78歲; 患者及其家屬均簽署知情同意書，抽取適量腦脊液，送天津華大醫學檢驗所進行mNGS檢測，同時進行腦脊液的常規、生化、細胞學、病毒抗體、病原菌涂片和血培養、PCR等檢查驗證試驗。腦脊液送檢至NGS報告時間為3-5個工作日。本研究通過川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

回顧性分析所有納入研究患者，將腦脊液采用傳統檢測方法檢測、未外送二代測序患者歸為常規組，外送腦脊液二代測序患者歸為NGS組，分析兩組患者基本情況，分析入院后腰穿抽取腦脊液進行腦脊液常規、腦脊液生化、一般細菌涂片、抗酸染色、墨汁染色、病原菌培養的結果。分析腦脊液外送宏基因二代測序結果。腦脊液mNGS由天津華大醫學檢驗所進行病原菌高通量測序檢測，采用IlluminaMiniSeq/NextSeq測序平臺進行測序。測序，結果以紙質版報告的形式呈現。

1.3 數據收集

收集納入的每位患者基本信息，包括性別、年齡(歲)、入院時間、出院時間以及腦脊液培養及鏡檢結果(具體病原微生物)、經二代測序所測得的微生物病原學結果，精確到病原菌種屬；統計每位入組患者的出院轉歸，包括好轉、治愈、未愈、其他形式。

1.4 統計學方法

采用統計學分析軟件SPSS 16.0對數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用t檢驗，結果用均數±標準差(±s)表示，分類數據采用Fisher檢驗和卡方檢驗進行比較。偏態分布的計量資料用中位數(四分位數)表示，計數資料用百分比表示。

2 結果

2.1 臨床資料

嚴格按照納排標準，共納入2020年6月1日至2021年7月31日川北醫學院附屬醫院神經內科收治的69例被確診為感染性腦炎/腦膜炎/腦膜腦炎患者，根據住院期間患者是否行腦脊液病原菌二代測序檢測并取得檢測結果，將未行二代測序的患者歸為常規組，已行二代測序的患者歸為NGS組。首先進行兩組間的基線水平分析，包括性別與年齡統計比較，常規組女性患者25例，男性患者18例，NGS組女性患者15例，男性患者11例(P>0.05)；常規組年齡(44.17±15.32)歲，NGS組年齡(44.35+15.48)歲(P>0.05)。基線如表1所示。

表1 兩組患者的性別、年齡基線水平比較

2.2 結合腦脊液NGS檢查結果的臨床診斷統計

在NGS組中，統計病原體檢測陽性并與臨床診斷相符的26例患者的臨床診斷：提示由病毒感染引起的腦炎16例(主要由皰疹病毒1、3、4型感染)，由結核桿菌感染引起的腦膜炎3例，由病毒感染引起的腦膜炎2例，由肺炎球菌、腦膜炎雙球菌引起的化膿性腦膜炎2例，由結核桿菌引起的腦膜腦炎1例，由新型隱球菌感染引起的腦炎1例，由新型隱球菌感染引起的腦膜炎1例(圖1)。

圖1 NGS組疾病分類

2.3 住院天數

統計常規組和NGS組各組患者的入院時間和出院時間，分析各組患者的總住院天數，常規組43例患者的平均住院天數為18.23±1.13天，其中最長住院天數為33天，最短住院天數為4天；NGS組26例患者的平均住院天數為14.23±1.09天，其中最長住院天數為26天，最短住院天數為4天(*P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組患者的住院天數比較

2.4 出院時轉歸

按照納入患者病歷首頁的出院時情況，分為好轉、治愈、未愈、其他4種轉歸，統計各組患者的不同轉歸情況的人數，常規組患者出院時好轉27人，占該組總人數的63%，治愈1人，占該組總人數的2%，未愈7人，占該組總人數的19%，其他8人，占該組總人數的16%；NGS組患者出院時好轉18人，占該組總人數的69%，治愈5人，占該組總人數的19%，未愈2人，占該組總人數的7%，其他1人，占該組總人數的5%(*P<0.05)(圖3)。

圖3 兩組患者的出院轉歸情況

3 討論

本研究回顧性分析了川北醫學院附屬醫院的單中心數據，這些研究資料來源于實際的神經科臨床工作。本單中心的回顧性研究結果顯示，顱內感染患者的流行病學在性別上無明顯差異，男女感染幾率相近；與腦血管疾病的易感年齡段來看，顱內感染患者的年齡普遍較年輕；在引起中樞神經神經系統感染的病毒中，人皰疹病毒1、3、4型最多見，以上發現與既往文獻報道一致[7,8]。由于神經系統感染性疾病屬于神經系統疾病中較常見的一類，且具有起病急、癥狀重、預后差的特點。其治療方案的選定取決于引起顱內感染的病原微生物種類，種類不同，治療方案將大相徑庭，治療是否及時將嚴重影響患者的預后轉歸。此前，臨床嚴重依賴腦脊液生化、常規、鏡檢及培養結果，結合頭顱影像學檢測結果，鑒別診斷。但由于腦脊液鏡檢及培養的陽性率低下且周期較長，且有些患者腦脊液生化常規不典型，嚴重影響臨床醫生對以上結果的判讀及對患者疾病的診斷與治療，若臨床經驗不足，可能嚴重影響治療效果及患者的預后[9,10]。近來，隨著基于分子層面的NGS的臨床應用發展，有學者比較研究發現，結合NGS診斷的49例CNS感染病例經抗感染治療效果明顯，證明與傳統病原體檢測方法相比較，mNGS給臨床醫生診斷與治療決策提供了很大幫助，證實腦脊液mNGS的應用是非常必要的。以往的PCR方法都有賴于預設目標的病原微生物基因序列，而mNGS的無偏倚、隨機的特性使其不僅可以檢測基因組已知的病原體，還可以檢測未知的新型病原微生物，從而成為發現新發感染性疾病的重要方法[11]。

目前，mNGS技術作為新型的病原微生物檢測技術，費用較傳統病原微生物檢測技術昂貴，對于病情反復，治療期間合并新的感染的患者，難以通過本方法監測致病菌的變化，且無法同步給出藥敏結果，故只能經驗性應用抗感染方案。此外，目前的mNGS技術對RNA 病毒檢測尚有不足，胞內菌如結核分枝桿菌的檢測由于序列數過低，對臨床結果解讀有一定影響。以上不足限制了該技術在臨床上的廣泛應用，近來隨之技術的發展，NGS技術逐步開始探索RNA病毒的檢測效能，并取得令人鼓舞的消息[12]。雖然，腦脊液mNGS還有待進一步完善與標準化，但已經為感染性腦炎與腦膜炎病因診斷帶來了顯著的進步。這種診斷方法為歷來顱內感染檢測診斷技術帶來跨越式發展，為病原菌的診斷識別提供精準指導，促進疾病的早期診斷和隨后的針對性治療，從基因層面成功攻破新出現的感染病原體和新發感染性疾病。在臨床實踐中，我們需要進一步探索腦脊液mNGS在CNS感染性疾病中的臨床適應證，同時由于NGS靈敏度非常高，致病病原菌的檢測易受背景菌及標本污染的影響，因此在標本采集及運送過程的要求更為嚴格[13]。因NGS的檢測價格高昂，應用mNGS要考慮患者病情的嚴重程度和醫療資源的具體情況等因素。在病原體診斷技術相對落后的基層醫院和臨床實踐中如何合理應用mNGS，并與傳統微生物檢測方法相結合，以提高神經感染性疾病的診治水平，仍然是需要深入探索與探討的問題。結合本研究分析，針對考慮顱內感染患者，建議盡早完善NGS檢測，盡早明確病原菌從而及時進行精準治療，減少臨床對顱內感染患者的誤診，做到精準治療及精確診斷，及時糾正病原菌對中樞神經系統的損害，減少患者疾病時限，盡量減少病原菌對中樞神經系統的損害，改善預后[14-17]。