磁性納米氣泡的超聲和磁共振雙模態造影

李斌，楊芳

(東南大學生物科學與醫學工程學院，江蘇 南京 210009)

0 引言

超聲診斷技術由于具有安全、低成本且能實時等優勢而被廣泛應用。但是醫用低頻超聲分辨率有限，不能很好地將肌肉組織和血管區分開,且難以觀察到微血管[1]。磁共振診斷技術分辨率高，但對于血管的敏感性低[2]。所以超聲和磁共振檢測微血管時都需要使用造影劑來提高超聲成像分辨率[3]。目前使用的超聲造影劑通常是直徑在10微米以下的氣泡，利用微氣泡對超聲波的非線性效應實現與周圍機體組織的區分，提供組織灌注成像方法[4]。而核磁造影劑主要使用的是小分子釓類螯合物和超順磁性納米顆粒。釓類磁共振造影劑用藥劑量大，機體產生不良反應的風險高，而磁性納米顆粒比釓類造影劑毒性更小，所以目前使用磁性納米顆粒做造影劑有較好的前景[2,5,6]。

目前迫切需要研發一種在超聲和核磁共振都能有優良造影效果的造影劑，且最好避免使用毒副作用大的材料。而磷脂類材料有較好的生物相容性，且有其兩親性結構(一端為親水性頭部和一端的疏水性尾部)，導致其可以在水相中進行自組裝形成脂質體和磷脂氣泡等結構[7,8]。與此同時形成的組裝體內部可以裝載顆粒(如脂質體內部可以裝載藥物)，或者膜殼表面進行其他顆粒的裝載[9,10]。

本文使用磷脂材料制備成脂質納米氣泡，且進一步將磁性納米顆粒裝載到脂質膜殼上形成磁性納米氣泡，最終用以實現良好的超聲核磁雙模態造影效果。

1 實驗材料

見表1。

表1 -1 實驗材料

2 磁性納米氣泡的制備與表征

2.1 磁性納米氣泡的制備

將二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)，二棕櫚酰磷脂膽堿(DPPC)，1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[(羧基(聚乙二醇)2000](DSPE-mPEG2000)，1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-amine)儲備液按9∶1∶1∶1的摩爾比例進行混合，每100mL上述混合物中加3mL甘油作為氣泡保護劑，取2mL混合溶液至體積為5mL的西林瓶中，再加入20-40μL濃度為2mg/mL的肉桂酸修飾的γ-Fe3O4磁性納米顆粒(MNPs)、2μL濃度為5mg/mL的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，在25℃下反應6h。密封后，將瓶中氣體替換為SF6。水浴加熱到60℃，5min后，插入注射器，通過反復擠壓注射器的方式制備磁性納米氣泡(MNBs)。擠壓完成后，放置在4℃環境中保存(MNBs結構如圖1所示)。

圖1 MNBs的結構示意圖

2.2 磁性納米氣泡的形貌表征

將MNBs稀釋5倍后，取20μL滴加在硅片上自然干燥后使用掃描電鏡(Ultra Plus S4800，Carl Zeiss，德國)對其進行形貌表征；取20μL滴加在銅網上自然干燥后使用透射電鏡(JEM-2100，JEOL，日本)對其進行形貌表征；取20μL滴加在載玻片上并使用光學顯微鏡(Ti2-U，Nikon，日本)觀察MNBs的膜殼形貌和其表面是否包覆MNPs。

2.3 磁性納米氣泡的粒徑、濃度的表征

粒度電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英國)可以測量納米顆粒的粒徑和Zeta電位。由于納米顆粒表面帶有電荷會形成如同膠體表面的電荷水電層，因此，納米顆粒表面會出現與顆粒表面電荷相反的緊密吸附層，在其外層會出現擴散層，擴散層中兩種電荷的離子都存在，但是兩種離子的量會有不同，與納米顆粒表面同電性的離子數量會較多，因而該層中的總體電性會與納米顆粒表面的電性相同，所以Zeta電位是測量納米顆粒擴散層中的電位(如圖2)。

圖2 Zeta電位的測量示意圖

使用粒度電位分析儀測量MNBs的粒徑，取50μL的MNBs加入粒徑皿中再加入950μL超純水稀釋到1mL，測量3次取平均(參數選擇為：溶液選擇water，材料選擇lipid，溫度25℃，預熱120s，循環次數為15次)。再取800μL原液加入電位皿中測量電位(參數選擇為：選擇溶液選擇water，材料選擇lipid，溫度選擇25℃，預熱時間選擇120s，循環15次)。

貝克曼庫爾特粒徑儀(Multisizer4e粒徑分析儀，Beckman Coulter，美國)是通過納米顆粒通過小孔時引起的孔兩端電極的電導率變化來測量納米顆粒的濃度和粒徑的大小，測量時測量杯中的部分待測液體吸入小孔內部，由于顆粒通過小孔時是單個通過，所以可以通過電流的每一次變化記錄下通過小孔的顆粒數，將此顆粒數除以吸入的待測液體的體積即為該顆粒的濃度值。并且由于不同大小的顆粒通過小孔時引起的電導率變化不同，所以也可以得出不同粒徑顆粒的分布情況。

使用貝克曼庫爾特粒徑儀測量磁性顆粒的濃度，選用20μm的小孔管測量磁性納米顆粒的粒徑，樣品加入量為20μL。

圖5 MNBs的粒徑電位和濃度表征

圖6 MNBs的不同比例稀釋后的超聲造影圖像結果

2.4 磁性納米氣泡的超聲造影

2.4.1 磁性納米氣泡的對比超聲濃度探索

制作超聲體膜：膜瓊脂、甘油和超純水按3:4:90的質量比例稱量，在2L的燒杯中加熱至90℃以上，連續使用玻璃棒緩慢攪拌混勻30min以上，至溶液變得透明無結塊或無團聚出現，將液體倒入容器中并在其中固定好1.5mL離心管作為樣品孔，冷卻過夜后倒出整塊體膜。

使用超聲設備(Vevo2100小動物超聲影像系統，Visual Sonics，加拿大)對普通磷脂氣泡和磁性納米氣泡進行體外超聲影像表征，超聲參數為18MHz，25dB，30% power。先對磁性納米氣泡進行不同比例的稀釋，以尋找合適的超聲造影濃度(按照8倍，16倍，32倍，64倍，128倍和256倍的比例對磁性納米氣泡進行稀釋)，對不同稀釋比例的磁性納米氣泡進行超聲對比造影(Contrastmode)。

2.4.2 磁性納米氣泡的超聲信號的時間變化數據采集

選擇16倍稀釋后的MNBs進行對比超聲造影，在造影增強區域中選取部分超聲造影區域(ROI)，讀取對比超聲造影的信號數值，按照時間變化進行采集，每次采集間隔時間為2.5min進行超聲數據采集，每次采集18s的超聲信號，超聲參數為18MHz，25dB，30% power，使用純水作為對照。

2.5 磁性納米氣泡的核磁共振造影

將磁性納米氣泡進行不同比例的進行稀釋(按照原濃度，8倍，16倍，32倍，64倍，128倍和256倍的濃度對磁性納米氣泡進行稀釋)裝入1.5mL離心管中，使用7T磁場的核磁共振儀(Biospec7T/20USR7.0T小動物核磁核共振成像系統，Bruker，德國)進行核磁成像進行T1核磁造影成像，TE為8.9ms，TR為400ms，FA為90°。并采用純水和磷脂溶液作為對照組。使用相同的稀釋比例對磁性納米氣泡進行了T2造影成像，TE為80ms，TR為2200ms，FA為90°。

3 實驗結果

3.1 磁性納米氣泡的形貌表征結果

如圖3所示，在掃描電子顯微鏡的圖像中，MNBs整體形態呈現出球形，其膜殼表面粗糙且附著有約10nm的磁性納米顆粒，掃描電子顯微鏡中的MNBs的直徑約700nm。而在透射電鏡圖像中可以觀察到磁性納米顆粒大致形狀為一個圓形，邊緣為磷脂膜殼，在膜殼上同樣可以看見許多磁性納米顆粒吸附，這進一步表明MNBs膜殼表面有磁性顆粒聚集。同時透射電鏡圖像中能看出中心的氣體核心部分，且在光學顯微鏡明場的圖像中，MNBs呈現出亮的圓環,其中心較為透亮(其中心為氣體核心)。磁性納米氣泡的掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和光學顯微鏡結果共同說明了MNBs具有外部的膜殼結構和中心的氣核，且磁性納米顆粒裝載于MNBs的膜殼上。

圖3 MNBs的形貌表征

3.2 磁性納米氣泡的粒徑、濃度的表征

根據粒徑表征結果可以看出，MNBs粒徑為(785.7±26.5)nm， 分散系數(PDI)為0.353，MNBs的Zeta電位為-22.7mV，MNBs的濃度為2.00×108個/mL。由濃度表征結果可知MNBs的粒徑主要是1μm以下，粒徑在1μm以上的數量較少，說明MNBs尺寸主要為納米級。

3.3 磁性納米氣泡的超聲造影結果

從磁性納米氣泡各個濃度的超聲造影結果中可以看出8至16倍稀釋時(濃度約為1.25～2.5×107個/mL)有較好的超聲造影效果，相比于純水可以觀察到明顯的超聲造影差異。但是稀釋16倍以上時，濃度的降低會導致磁性納米氣泡的造影效果降低，最終不能形成一個完整的圓形。所以本實驗所制備的磁性納米氣泡的最佳造影稀釋濃度為稀釋8至16倍。

選擇16倍稀釋的MNBs濃度(1.25×107個/mL)進行超聲的時間掃描，每隔2.5min進行數據結果的記錄，由超聲數值結果可知磁性納米氣泡與純水的超聲造影在數值上存在明顯差異，純水數值較低且基本保持不變，而MNBs的超聲數值信號較大，隨時間延長超聲數值緩慢降低。

3.4 磁性納米氣泡的核磁共振造影效果

由于病變組織在T1成像較暗，所以使用的T1造影劑提高成像亮度才能增強造影，所以需要比純水的圖像亮[2,3]。而病變組織與正常組織在T2成像都較亮，所以T2造影劑使病變區域變暗才能突出區別，所以需要比純水的圖像暗[2,3]。MNBs稀釋到合適的倍數時能增強T1造影成像效果。本實驗發現T1造影時8至16倍為合適的稀釋倍數，此時MNBs(1.25～2.5×107個/mL)成像亮度比純水亮，有T1造影增強效果。當T2造影時，加入不同濃度的MNBs成像都比純水暗，所以MNBs有T2造影增強效果。

圖7 MNBs的對比超聲時間變化數值結果

圖8 MNBs的核磁共振造影效果

4 總結與展望

本文成功制備了超聲和核磁共振雙模態造影的磁性納米氣泡，并且通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和光學顯微鏡觀察到了其顆粒包覆的膜殼和氣體核心的結構。并測定了磁性納米氣泡的粒徑和濃度，確定了其粒徑為納米級別。最后進行了超聲和磁共振造影,結果發現，8至16倍的濃度稀釋可以有較好的超聲和T1的核磁成像效果，而不同濃度稀釋的磁性納米氣泡都有較好的T2造影效果。

在后續的實驗中如果能夠增加一些其他的納米顆粒如金納米顆粒，就能進一步制備超聲、核磁和CT的三模態造影增強劑。而目前的多模態造影劑需要進一步研究如何利用更廉價的材料或者提高材料的利用效率和造影效果，從而實現降低單瓶造影劑的售價。