第二類醫療器械口腔潰瘍含漱液的生物學評價研究

王鑄輝，吳靜紅，肖本友，李健和

(1.湖南省醫療器械檢驗檢測所，湖南 長沙 410014；2.康多寶醫療健康產品(湖南)有限公司，湖南 長沙 410010；3.中南大學湘雅二醫院藥學部，湖南 長沙 410011)

0 引言

國外Access Pharmaceuticals,Inc.公司以苯甲醇為主要成分開發上市了口腔潰瘍含漱液，并以第二類醫療器械在我國進口注冊上市，注冊號為：國食藥監械(進)字2012第2630299號，商品名：妙固(MuGard)，組成成分為水、卡波姆均聚物A、甘油、糖精鈉、磷酸、檸檬酸、苯甲醇、氫氧化鉀、聚山梨醇酯60，其中苯甲醇濃度為1.5%，適用于預防和治療各種口腔黏膜炎、口腔潰瘍(復發性口腔潰瘍或手術、假牙、正畸等引起的創傷性潰瘍)，預防和治療各種放化療性口炎。國內外文獻[1-6]報道的臨床應用情況顯示：口腔潰瘍含漱液用于緩解口腔潰瘍及口腔炎癥創面所帶來的疼痛，安全有效；對治療頭頸部放療患者口腔黏膜炎有很好的預防及治療效果。據此，我們也研制開發了第二類醫療器械口腔潰瘍含漱液，現將其生物學評價研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器

AE200電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；Thermo 311 二氧化碳培養箱(美國賽默飛世爾科技公司)；BSC-100IIA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司)；XDS-1倒置顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；WMK-02隔水式恒溫培養箱(山東濰坊精鷹醫療器械有限公司)；Plus 384酶標儀(美國 Molecular Devices公司)。

1.2 試藥

口腔潰瘍含漱口液(康多寶醫療健康產品(湖南)有限公司，批號：20190111)；MTT溶液(北京索萊寶科技有限公司)；DMSO溶液(CALBIOCHEM公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；1640培養基(GIBCO公司)；氯化鈉注射液(湖南科倫制藥有限公司)；弗氏完全佐劑(CFA)(SIGMA公司)；植物油(山東魯花集團有限公司)。

1.3 動物

普通級實驗兔，體重2.0-2.5kg，武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供；白色豚鼠，體重350-500g，武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供；ICR小白鼠，SPF級，體重18-22g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 細胞毒性試驗

(1)試驗方法[7]

細胞培養液的制備：使用前將分裝好的胎牛血清50mL加入1640培養基至500mL，混勻。

供試液的制備：取無菌樣品3.08g，按1:40比例加入123.2mL含血清細胞培養液，37℃±1℃條件下放置24h制備浸提液。

陰性對照液：高密度聚乙烯浸提液。

陽性對照液：5%DMSO的細胞培養液。

細胞混懸液的制備：取正常培養的L-929細胞，消化吹打計數，平均為183×104個/mL。將0.3mL細胞混懸液加入培養液中至54.9mL，稀釋至183倍，濃度為1×104個/mL。吸100μL細胞混懸液注入培養板內。放入含5%的二氧化碳恒溫培養箱中培養24h。棄去原培養液，每孔分別加入100μL的空白對照液、陰性對照液、陽性對照液、試驗樣品浸提液，每組設8孔。分別于72h后棄去孔內的液體，每孔加入20μL濃度為5g/L的MTT溶液，在二氧化碳恒溫培養箱中培養4h。棄去孔內的液體，每孔分別加入150μL DMSO溶液，10min后振蕩，在酶標儀上用雙波長(570nm和630nm)法測定吸光度。計算細胞相對增殖度(relative growth rate，RGR)，RGR=供試品(陰性、陽性組)吸光度/空白對照組吸光度×100%，并判斷細胞毒性級別。RGR分級如下：分級為0、1、2、3、4，對應的相對增殖度為≥100、80-90、50-79、30-49、0-29。

(2)結果

根據標準規定，試驗組相對增殖度為0級或1級為合格；試驗組相對增殖度為2級，應結合形態綜合評價，輕微毒或無毒的為合格；試驗組相對增殖度為3級-4級為不合格。由表1可知，供試品的細胞毒性為1級，為合格。

表1 細胞毒性實驗結果

2.2 皮內反應試驗

(1)試驗方法[8]

供試液制備：取口腔潰瘍含漱液4.08g，放入一玻璃器皿中，加入0.9%氯化鈉注射液20.4mL，封閉后置壓力蒸汽滅菌器內121℃浸提1h，即得供試品浸提液。

空白對照液：0.9%氯化鈉注射液。

取試驗兔雌雄各1只，體重2.0-2.5kg，要求無任何皮膚病或損傷，未做過任何試驗。實驗前24h在兔脊柱兩側各剪剃5cm×15cm區域兔毛，避免損傷皮膚。試驗時用75%乙醇清潔暴露皮膚，在每只兔脊柱一側的10個點，皮內注射0.2mL供試品浸提液，在每只兔脊柱一側的5個點，皮內注射0.2mL空白對照液，注射后24h、48h和72h，觀察注射局部及其皮膚組織反應，包括紅斑、水腫和壞死等，進行皮膚刺激性評分，見表2，計算原發性記分與原發性刺激指數(PII)。供試品浸提液記分減去空白對照液記分為每只兔的原發性刺激記分，每只兔原發性刺激記分相加再除以兔總數為原發性刺激指數(PII)，按原發性刺激指數(PII)：0.0-0.4、0.5-1.9、2.0-4.9、5.0-8.0劃分相應反應等級：無、輕度、中度、重度。

表2 皮膚刺激性反應評分標準

(2)結果

口腔潰瘍含漱液注射于試驗兔后24h、48h、72h，供試品浸提液記分均為0分、空白對照液記分均為0分、原發性刺激記分均為0分、原發性刺激指數均為0分，肉眼觀察試驗兔均未見紅斑、水腫及壞死現象，口腔潰瘍含漱液對動物機體無皮內刺激反應。

2.3 皮膚致敏性試驗

(1)試驗方法[9]

供試液制備：取口腔潰瘍含漱液4.0g，放入一玻璃器皿中，加入0.9%氯化鈉注射液20mL，置壓力蒸汽滅菌器內121℃滅菌60min，即得供試品浸提液。將供試品浸提液、陰性對照液、5%甲醛陽性對照液與弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合，用力攪拌數分鐘至完全乳化為止。

將白色豚鼠30只隨機分為3組，每組雌雄各半，試驗前24h剃除豚鼠肩胛骨內側部位4cm×6cm區域毛發。試驗時用75%乙醇清潔豚鼠背部去毛區，在每只豚鼠去毛區做6點對稱的皮內注射。靠頭部2點部位A：注射弗氏完全佐劑與選定的溶劑等體積混合的穩定性乳化劑。中間2點部位B：注射未經稀釋的浸提液試驗樣品；對照組僅注射相應溶劑。靠尾部2點部位C：試驗樣品與弗氏完全佐劑和溶劑等體積混合的穩定性乳化劑。各點相距1-2cm，每點注射量為0.1mL。皮內注射后7d，在注射部位再次剃毛，用75%乙醇清潔。若未出現刺激反應，每一試驗區用10%十二烷基硫酸鈉石蠟液預處理，在局部斑貼前24h涂抹、按摩試驗區皮膚。24h后將2cm×4cm濾紙浸入供試品浸提液(部位B采用的濃度)或陰性對照液、陽性對照液至飽和，將其貼敷于豚鼠背部注射部位，封閉固定48h。

于誘導完成14d，在豚鼠上腹側未實驗部位剃毛，用75%乙醇清潔，將2cm×2cm濾紙浸入供試品浸提液(按部位C選定的濃度)或陰性對照液、陽性對照液至飽和，將其貼敷于剃毛區，封閉固定24h。將貼敷物取下后24h和48h，分別觀察豚鼠激發部位皮膚情況，按如下給出的Magnusson和Kligman分級標準對每一激發部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行分級，敷貼試驗反應：無明顯改變、散發性或斑點狀紅斑、中度融合性紅斑、重度紅斑和水腫，其相對應的等級分別為：0、1、2、3級。

2 結果

試驗期間豚鼠無任何異常表現，沒有中毒癥狀，也沒有豚鼠死亡。陰性對照組和供試品組激發后1h、24h、48h均未出現紅斑和水腫，致敏試驗為陰性。而對照組激發后1h、24h、48h均出現中度、重度紅斑和水腫，致敏試驗為陽性。在本試驗條件下，口腔潰瘍含漱液對動物機體無致敏反應。

2.4 急性全身毒性試驗

(1)試驗方法[10]

供試液制備：取口腔潰瘍含漱液4.0g兩份置浸提器內，其中一份加入0.9%氯化鈉注射液20mL，另一份加入植物油20mL，置37℃±1℃恒溫箱中，于24h內使用。同法制備介質對照液。

取雌雄各半小白鼠10只，隨機分為試驗組和對照組，經尾靜脈分別注射氯化鈉浸提液和介質對照液，注射量：0.5mL/10g，注射速度：0.1mL/s。另取10只由腹腔分別注入植物油浸提液和介質對照液，注射量：0.5mL/10g。注射完畢后，觀察小白鼠即時反應，并于4h、24h、48h、72h觀察和記錄試驗組和對照組的一般狀態、毒性表現和死亡動物數。注射后動物反應觀察指標見表3。

表3 注射后動物反應觀察指標

(2)結果

試驗組和對照組的氯化鈉浸提液、試驗組和對照組的植物油浸提液分別注射于小白鼠體內，即時反應、4h、24h、48h、72h觀察都無毒性癥狀，體重也并未下降。根據標準規定，在72h觀察期內，試驗組動物的反應不大于對照組動物，則判斷供試品合格。因此，口腔潰瘍含漱液無急性全身毒性反應。

3 討論

生物學評價研究在于預測產品使用過程中對機體帶來的潛在危害性，試圖提供安全信息，將不安全的風險減少到最低程度。對口腔潰瘍含漱液的生物學評價研究包括細胞毒性試驗、皮內反應試驗、皮膚致敏試驗以及急性全身毒性試驗，以保證產品的質量和臨床使用的安全性。

本課題成功制備了口腔潰瘍含漱液，其配方合理，制備工藝簡單可行，質量可控，穩定性、安全性良好，抑菌作用顯著，本品的研制成功將對多種口腔致病菌和非致病菌有抑制和殺滅作用。本品用于緩解口腔潰瘍及口腔炎癥創面所帶來的疼痛，安全有效；對治療各種口腔黏膜炎、口腔潰瘍(復發性口腔潰瘍或手術、假牙、正畸等引起的創傷性潰瘍)、各種放化療性口炎有很好的預防及治療效果。