高通量測序技術的發展及其在臨床檢測中的應用

王玉靜，陸梓涔，陳俊煜，陳毅歆,*,尤瑞孌

(1.廈門大學公共衛生學院，分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，福建 廈門 361102；2.廈門大學生命科學學院，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建 廈門 361102；3.廈門國際旅行衛生保健中心，福建 廈門 361100)

測序技術的出現，直觀而深刻地揭露了核酸分子的深層信息，為人類進一步探索基因結構與功能提供了決定性的技術手段.高通量測序在過去約20年中得到了迅猛的發展，也成功實現了商業化，與之相關的基礎應用、科研探究以及臨床應用隨之大幅增加[1].隨著“精準醫療”概念的提出，臨床應用上對高通量測序的需求越來越大，病原學診斷、檢測與遺傳病、腫瘤等疾病的精準診斷等應用領域對高通量測序技術的要求也越來越高.而在高通量測序技術出現之后，發生的幾次世界性范圍的傳染性疫情中，高通量測序技術也逐漸扮演起重要的角色[2].高通量測序技術作為精準醫療的重要基石，對精準醫療做出了極大的貢獻，在臨床相關的病原微生物檢測、臨床腫瘤學、16SrRNA基因以及內轉錄組間隔區(internal transcribed spacer,ITS)測序、遺傳疾病檢測、傳染病監測以及新型病毒的發掘等方面發揮出優勢[3].高通量測序技術的發展歷程、不同平臺的特點、測序原理的差異以及不同領域的應用都是受到較多關注的焦點.本文將對以上關注焦點進行介紹與討論，同時對高通量測序技術在臨床檢測中的應用進行詳細闡述.

1 測序技術的發展歷程

Frederick Sanger于1975年發明了“雙脫氧鏈終止法”基因測序技術，這是科學史上出現的第一種基因測序技術[4]；另一種基因測序技術是1977年Walter Gilbert發明的“化學測序法”[5].這兩種測序技術均作為一代測序的標志性技術而廣泛應用，其中雙脫氧鏈終止法因操作更簡便穩定而被更廣泛應用.在過去的20年內，基因測序技術有了較大的進步與發展，一代測序仍然穩定占據部分市場，二代測序、三代測序也快速占據了較大的市場份額，基因測序技術在規模、通量以及應用上都有了極大的發展.一代測序雖然在過去50年內占據著極大的市場，然而其存在通量低、數據產出較低以及成本較高等問題，雖然目前有著不可取代的地位，但是仍然無法滿足當前分子生物學、醫學研究以及臨床診斷對于高通量、高效率、高產出的測序需求.二代測序相對于一代測序而言準確率略微降低，但通量和產出增加，可以實現同時對多個樣本進行測序，單位時間內的數據產出量相比于一代測序實現了數量級的增長.自2005年第一臺二代測序儀器羅氏(Roche)454焦磷酸測序平臺誕生以來，隨后陸續推出的二代測序技術平臺包括：2006年Illumina公司推出的Solexa測序平臺、2007年美國ABI公司推出的SOLiD測序平臺和2010年美國Life Technologies公司推出的半導體測序平臺[6]，各占據一定的市場份額.其中454 Life Science后來被Roche公司收購，但由于二代測序市場的競爭日趨激烈以及較新的測序方法出現，該測序方法被逐漸淘汰.2013年Roche公司宣布關閉454測序業務，并于2016年全面終止相關服務，454測序儀被市場淘汰.2008年Invitrogen公司和美國ABI公司合并成立Life Technologies公司，開始發展半導體測序，占據了部分測序市場，隨之SOLiD測序也逐漸淡出市場.2006年開始Illumina公司進入了二代測序市場，且在此后的10年時間內，Illumina公司占據了大部分測序市場，于2010年開始陸續推出的Hiseq系列測序儀，更是迅速成為二代測序平臺中的主流測序平臺.

作為中國高通量測序的先驅，華大基因于2014年推出首款二代測序儀——BGISEQ-1000，繼而在2016年陸續推出了BGISEQ-500等型號的測序儀.該測序平臺在大規模DNA測序和小RNA分析中的能力已得到證明，但BGISEQ-500平臺在轉錄組分析中的性能仍有待提升[7].每種測序平臺都有自身特點，在數據產出量、測序讀長、測序準確率以及測序成本等方面各有不同的表現[8].

二代測序技術平臺盡管在測序通量、數據產出量以及應用領域上相較于一代測序有顯著優勢，但仍然存在一定的短板，如：測序讀長較短導致在測序過程中會產生大量高度碎片化的重復片段，尤其在進行大基因組測序時，測序拼接成為一個較大的挑戰；且相較于一代測序而言，二代測序所需的測序時間顯著增加，尚不能完全滿足臨床樣本的快速診斷需要[9].在此背景下，可滿足長讀長和快速測序需要的三代測序平臺應運而生：2008年英國ONT公司首次推出了一款以納米孔單分子測序為原理的測序儀器，但當時該平臺還不夠穩定，無法投入正常使用；2008年美國Helicos Bioscience公司以單分子測序(single molecule sequencing, SMS)技術為原理的Heliscope測序平臺發布上市；2009年美國Pacific Bioscience公司推出了單分子實時(single molecule real-time,SMRT)測序技術；2014年英國ONT公司推出了MinION測序儀，可供用戶使用.三代測序平臺可以直接對給定的DNA或RNA模板進行測序，實現了真正意義上的實時測序，當核酸模板通過測序儀即可產生信號.相較于前兩代測序平臺，三代測序平臺主要的改善有：1) 讀長變長，可在一個反應內讀取成千上萬堿基的讀長，理論上可達無限長；2) 測序流程簡化，測序時間減少，在文庫構建以及上機測序等流程上有所精簡，減少了樣本的測序時間；3) 避免了PCR擴增技術造成的擴增偏好；4) 可直接測定堿基上的修飾情況，如堿基甲基化[10].圖1展示了基因測序發展歷程中的里程碑事件.

圖1 測序技術發展時間軸

2 主流二代測序平臺的發展概況

一代測序技術運用多年仍然生機蓬勃，二代測序技術更是在短時間內迅速崛起成為市場主流，并在近年來被廣泛應用于臨床病原體鑒定診斷中[11].不同于Sanger測序，二代測序將酶促DNA反應、堿基測序與數據收集同步進行，因此可以同時對數千到數十億條DNA模板進行測序[12].以下三家公司的測序平臺因不同的測序原理在各方面存在一定差異，但由于平臺側重點不同，都在不同時間段成為當時較主流的測序平臺，并且側重應用于不同領域.

2.1 羅氏454焦磷酸測序平臺

Roche公司的454焦磷酸測序平臺是國際上第一臺相對較成熟的二代測序平臺，屬于循環微陣列法平臺，其測序技術基礎是邊合成邊測序(sequencing by synthesis,SBS)技術[13].該項測序技術的測序原理主要依靠熒光信號的生物發光，將模板進行PCR擴增后，與相應的引物雜交，并與三磷酸腺苷雙磷酸酶、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、底物熒光素酶和5’-磷酸硫腺苷共同孵育，然后進行相應的酶促反應；在每次實時測序實驗中，模板只與一種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)進行配對反應，在此酶促反應中，DNA聚合酶以該dNTP作為原料合成互補鏈，會釋放出等物質的量的焦磷酸基團[13].

454測序技術的主要優勢在于測序時間較短，且準確率較高(可達99%)，在單位時間內產生的片段數量多.該測序平臺在一次測序工作中可以產生100萬條序列，序列的平均長度400 bp，數據總量約500 M.454測序平臺已經被應用到多個方面，均取得了較理想的結果.454 Life Sciences被Roche公司收購后，Roche公司在454測序測序平臺的基礎上又相繼推出GS FLX平臺[14]，由于后期二代測序市場上新的測序方法不斷更迭以及該平臺的測序成本較高等原因，該測序平臺已于2016年宣布全面停止相關的測序服務.

2.2 Illumina測序平臺

Illumina測序儀也稱為Solexa分析儀，其測序原理與Sanger測序法類似，將合成核酸的原料dNTP用4種不同的熒光進行標記，并偶聯可逆的終止劑，固相基質上可以容納數百萬的模板克隆，每個固相基質上可以同時讀取10億個堿基.2005年Solexa公司收購合并了儀器公司Lynx Therapeutics，新公司成功地將Solexa原型轉化為商業測序儀器，2006年推出第一個Solexa測序儀——Genome Analyzer.該測序平臺具有高精準度、高靈敏度、高特異性以及相對較低成本的特點，并在2010年成功推出Hiseq系列測序儀，目前在遺傳疾病分析、腫瘤癌癥檢測以及功能基因組測序等領域占據主要的測序市場.Illumina Hiseq系列測序儀具有PE150的讀長，相較于該系列其他測序儀讀長較長，其優勢主要在于其測序精準度最高可達99.9%，而且相較于其他二代測序平臺測序成本較低，但該系列也有相應的缺點——序列讀長較短[15].

2.3 SOLiD高通量測序儀

2006年7月，美國ABI公司推出SOLiD測序平臺，該平臺基本原理的特點在于每一步測序反應都是通過連接反應完成的，通過PCR反應進行平行擴增測序.SOLiD測序平臺支持兩種測序文庫：一種是與Illumina測序平臺的文庫構建類似，均先將DNA模板片段化，在片段的DNA模板兩端加上接頭，即成功構建文庫；另一種是配對末端文庫，依靠酶切反應加上接頭，成功構建文庫[16].2010年末ABI公司發布了第五代測序系統——SOLiD 5500xl測序系統，該系統在讀長、精準度以及數據產出量上都實現了較大進步，分別達到85 bp，99.99%和30 G，在未退出市場前，曾是二代測序平臺中精準度最高的平臺[16].

2008年在Life Technologies公司收購Ion Torrent公司之后，開始陸續推出Ion PGM和Ion Proton系列測序儀，且是該公司目前主推的測序儀，因此SOLiD測序平臺逐漸淡出市場.2010年Life Technologies公司發布Ion PGM測序儀，目前有3款芯片并在不斷改進，測序通量也在不斷增加；2012年發布Ion Proton測序儀，拓展了該系列測序儀在更多領域的應用.2013年Life Technologies公司又被Thermo Fisher公司收購；2015年9月1日發布新產品S5系列Ion S5/the S5 XL，是Proton和PGM相結合產生的產品，相較于Proton,PGM新系列更加容易操作，且節省了較多的測序時間[3].

2.4 不同二代測序平臺的比較分析

多種不同的二代測序平臺在不同方面也有不同的表現.其中羅氏454測序儀作為最早問世的二代測序儀，讀長較長，運行較快，然而檢測成本較高，設備較大，可及性不高，且錯誤率也相對較高，目前在測序市場中已經停產；Illumina測序儀作為目前市場上應用最廣泛的二代測序儀，讀長較短，運行較慢，成本也相對較高，設備較大，對于實驗人員要求較高，但測序錯誤率較低，適用于全基因組測序和宏基因組測序，應用領域廣泛[7]；SOLiD測序儀也是曾經較常見的二代測序儀，測序準確率較高，然而讀長較短，運行較慢，常用于外顯子測序和基因突變測序，目前也已淡出市場[12].

3 三代測序平臺的發展現狀

隨著二代測序平臺的成功應用，三代測序平臺開始陸續推出.不同于二代測序平臺的部分特點，三代測序在讀長上進行了更大改善，測序時間也相應減少，測序流程更簡便，測序設備更便攜，測序成本更低.三代測序不依賴于PCR擴增技術，其最大特點就是SMS技術[17].目前市面上出現的SMS平臺分別為美國Heliscope BioScience公司的SMS技術[17]、美國Pacific Bioscience公司的SMRT技術[18]、VisiGen Biotechnologies公司的熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術[19]以及英國ONT公司推出的納米孔SMS技術[10].

3.1 SMS測序平臺

2008年，美國Helicos Bioscience公司推出HeliScope單分子測序平臺，是繼二代測序平臺之后出現的第一個可以商品化應用的三代測序儀，其測序的主要原理是一種基于光學信號的SBS技術，但不同于二代測序的是該方法不依賴于PCR擴增技術，先隨機將待測模板進行打斷與篩選，在對片段化模板進行末端修復之后在片段3’-末端連接上50 bp結合有熒光標記的poly(A)尾巴，含接頭的文庫可以通過末端poly(A)尾巴結合固定在固相基質的Oligo d(T)探針上，類似于Solexa測序，該方法也需要將熒光染料標記的4種dNTP依次加入微反應中，在DNA聚合酶的催化反應下，通過堿基互補配對釋放出相應的熒光信號，最后依靠增強型電荷耦合元件(intencified charge coupled device,ICCD)相機進行光學信號的收集[16]，在測序上避免了擴增時引入的堿基錯配以及擴增偏好性.該測序方法也存在相應的不足，就是對于光學信號收集的設備要求較高，并且在測序過程中由于信號較弱容易產生測序誤差，導致準確率降低；因此該平臺為提高精準度采取了兩次測序(two-pass sequencing)，增加了測序成本[20].然而由于該平臺初始讀長較短，約32 bp，且測序成本較高，測序準確率較低，錯誤率高達1%，所以該測序平臺并未得到廣泛的應用，2012年底Helicos正式申請破產保護.

3.2 SMRT測序平臺

美國Pacific Bioscience公司推出的SMRT測序技術是目前三代測序平臺中應用最廣泛的一項測序技術.SMRT測序技術相較于其他測序技術而言有較大的優勢，該方法同樣基于對單個DNA分子進行測序，采用4種熒光標記的dNTP以及零級波導(zero-mode waveguide,ZMW)的納米結構作為測序技術的主要基礎.ZMW這種納米結構是一種孔狀納米光電結構，光線在通過ZMW后會呈現指數級衰減，被衰減的光線最終只能使孔內靠近基質的部分被照亮;ZMW作為測序的微反應器，會提前在微反應器中結合測序反應所需要的phi29 DNA聚合酶；在構建文庫時，將待測模板與引物結合，混合4種熒光標記的dNTP一同加入微反應器ZMW中;測序反應過程中，待測模板DNA以4種熒光標記的dNTP作為原料進行合成時，所連接的dNTP會因反應而在ZMW底部短暫停留，熒光收集設備則可以收集到配對dNTP的熒光信號，從而實現測序[21].該平臺在讀長上實現了較大的突破，其中PacBio RSⅡ測序平臺最長讀長能夠達到30 kb，平均讀長約8.5 kb，且該平臺也具有三代測序平臺普遍共有的優勢——測序流程更簡便，構建文庫時間縮短，且不依賴于PCR擴增技術.然而與SMS技術類似，該測序技術同樣依賴于單分子產生的熒光信號進行測序，因此測序的準確率偏低，最高僅可達到87.5%;盡管通過增加測序次數以及后期數據分析矯正，準確率可以提高，但是相對于Sanger測序以及二代測序，準確率仍然較低[21].

3.3 納米孔SMS平臺

2014年，英國ONT公司推出了第一個商用的測序平臺——MinION，該測序平臺的主要測序原理是基于待測模板通過生物納米孔時不同堿基產生的不同電位差而實現電信號向堿基信號的轉變.Nanopore測序系統主要由納米孔、薄膜以及馬達蛋白組成，其中馬達蛋白是一種DNA解旋酶，在構建文庫時，馬達蛋白與接頭會一同連接在待測模板的一端；當將制備好的文庫滴加到納米孔上時，馬達蛋白通過解旋作用將雙鏈DNA變為單鏈通過納米孔；A、T、C、G 4個堿基通過納米孔產生不同的電位差，這種電信號會被傳導電子元件(application-specific integrated circuit,ASIC)以及MinKNOW軟件接受并進行初級處理[22].該測序平臺的序列讀長與PacBio測序平臺相似，達10 kb，理論上可達無限長.然而相較于PacBio測序平臺，MinION測序平臺的錯誤率更高，準確率僅65%～88%.

前期使用9.4版本芯片或者其他版本芯片Flow cell進行測序時，測序準確率非常低，僅約90%；后續平臺推出9.5版本Flow cell芯片并且采用1D2(DNA正反鏈測序，相互矯正)建庫方式，在一定程度上提升了測序準確率[23].

3.4 FRET測序平臺

FRET測序平臺在對樣本核酸進行測序時，測序過程中4種脫氧核苷酸分子被4種不同的熒光受體所標記，隨著測序引物延伸，4種不同的熒光受體會發出特異的熒光，不同的熒光分別代表不同的4種脫氧核苷酸分子.該測序平臺由VisiGen Biotechnologies公司研發并推出，讀長較長，平均讀長在1 500 bp以上，測序準確率相對于其他三代測序平臺較高，并且測序時長較短;但該平臺因為缺乏具體應用的技術參數，所以并未得到廣泛應用[19].

3.5 不同三代測序平臺的比較分析

由于不同測序平臺之間的測序原理與建庫方式等有較大的不同，各測序平臺側重應用的領域也不盡相同，且不同測序平臺的測序成本、測序時間以及測序準確率也有一定差異(表1).三代測序平臺的讀長都較長，且不依賴于PCR方式構建文庫，測序成本較低，測序時間較短；然而相對于二代測序平臺，三代測序平臺的測序錯誤率都較高，后續數據處理分析非常依賴于處理軟件與數據庫的選擇與使用.三代測序平臺中，英國ONT公司的Nanopore測序儀對實驗人員要求較小，可及性極高.對于目前的三代測序平臺而言，如何提高測序的準確率是較受關注的方面.目前主流三代測序公司均在測序設備穩定性以及后續數據處理分析上進行了很大的改進與完善.

表1 三代測序平臺對比

4 高通量測序平臺的臨床應用

Sanger測序作為傳統檢測方法中較典型的方法，由于該平臺測序規模的短板，其應用的領域較有限.而高通量測序作為近幾年較受關注的測序技術，在各大領域有著廣泛的應用以及突出的效果[25]，如臨床預測、診斷、治療相關領域.下文主要從與臨床有關的不同領域對高通量測序的應用(表2)進行詳細闡述.

表2 高通量測序平臺的臨床應用

4.1 臨床微生物病原學鑒定

細菌、真菌、支原體、衣原體、寄生蟲、病毒等微生物與人體的健康系統穩定息息相關.人體中有著由細菌、真菌、病毒等微生物組成的龐大與復雜的胃腸道系統，且人體許多疾病的發生都與微生物系統的失調或微生物的入侵有著極其緊密的關系，而高通量測序技術的出現為這些微生物菌群的鑒定檢測與研究提供了有力的技術支持[26].針對微生物病原學檢測，基于測序策略的不同，主要可以分為以下3種：全基因組測序、靶向目標測序和宏基因組測序.

1) 全基因組測序是對未知基因組序列的物種進行個體的基因組測序.目前二代測序和三代測序均支持對個體物種進行全基因組測序，對于微生物的全基因組測序，可以準確從科、屬、種水平上對樣本中的微生物進行鑒定分析；并且可以根據對耐藥基因和毒力基因的比對分析預測該種微生物的耐藥情況以及預后情況；最重要的是，在發掘出罕見或者未知的微生物方面，全基因組測序必不可少[24].

Zhou等[27]基于二代測序平臺以及擴增子測序等技術對一種未知的新型病毒進行全基因組測序，發現該病毒與人類冠狀病毒HKU2相似，與蝙蝠體內寄宿的某種冠狀病毒序列一致性達98.48%.研究人員基于二代測序平臺對該新型冠狀病毒進行全基因組測序，迅速掌握了該病毒的傳染性與毒力的分子學基礎，研究了該病毒的衍化過程，為其治療與防控提供了有利的測序分析手段[27].Wu等[28]研究人員從武漢新冠肺炎患者的樣本中提取到新型冠狀病毒的RNA，并且通過Illumina Miseq對提取到的RNA進行了測序及全基因組序列拼接.研究人員共得到56 565 928個讀取序列，對以上讀取序列進行初步組裝拼接之后，形成了384 096個重疊群，其中長度最長的一個重疊群(30 474 bp)具有較高的豐度，與一株從蝙蝠分離得到的bat SL-CoVZC45的基因序列一致性達89.1%[28].可見二代測序平臺在新病毒發現上有很大的潛力，對于流行性疾病的診斷與治療有重大意義.

在新發傳染病未知病原體的發掘、微生物耐藥性分析方面，Illumina測序平臺相對而言使用較為廣泛并且表現良好，其中未知病原體的全基因組測序目前主要依靠Illumina Miseq等測序儀完成，該測序儀在迅速、精準、高效獲取病原體基因以及基因比對分析方面有著較好的表現.

2) 靶向目標測序是指對某物種的某特定區域或某特定功能的基因進行靶向測序.對于臨床微生物病原學檢測來說，主要集中于對細菌的16SrRNA基因進行靶向目標測序.16SrRNA基因是原核生物所特有的基因片段，由于該基因片段在細菌中普遍存在，既具有相對保守的區域又有高度可變的區域，所以經常被用作細菌鑒定分類的標準[29].根據16SrRNA基因序列的保守區設計相應的引物，對可變區進行靶向擴增，并基于高通量測序平臺對可變區進行靶向目標測序，后期借助生物信息學分析手段對樣本中細菌進行精準的種屬鑒定.類似地，針對真菌的ITS靶向目標測序也可以對真菌進行精準的鑒定與分類.針對16SrRNA基因和ITS的靶向目標測序，不僅對微生物可以進行準確的科、屬、種鑒定分析，還可以從序列信息中得到毒力基因信息，為抗生素藥物的耐藥性、代謝等臨床學和流行病學研究提供一定的幫助.

Schloss等[30]通過PacBio SMS技術對16SrRNA基因進行測序，將從社區和自然環境中獲取的人糞便樣本、老鼠糞便樣本以及土壤樣本進行混合，并對樣本進行相應的靶向測序，主要獲取并分析了V4、V3～V5、V1～V3、V1～V5、V1～V6以及V1～V9等可變區的測序數據；基于數據分析處理方式將該測序平臺對16SrRNA基因中的可變區V1～V9的測序錯誤率從0.69%降低至0.027%.在對物種多樣性、微生物組成和微生物進化開展的研究中，種屬鑒定的精準度再次提升.

3) 宏基因組測序是指從臨床樣本或者環境樣本中直接提取全部微生物的核酸，構建宏基因組測序文庫并進行測序.該方法不需要進行菌株分離培養，因此很大程度地避免了分離效率低和靈敏度低的問題.針對環境樣本(如土壤、海水等中復雜的微生物群落)以及人體口腔、糞便、腸道等部位的樣本，通過宏基因組測序可發現樣本中一些無法培養或難以培養的微生物種類，發掘復雜樣本中未知的罕見微生物種類[31].

Salipante等[32]發現一名男子臨床癥狀為左下葉肺炎，口腔分泌物增加，有多個組織壞死，前期抗生素治療方案效果不明顯；研究人員基于Illumina Miseq測序儀對患者肺泡灌洗液樣本進行宏基因組測序，并對測序數據進行較完善的處理分析，包括使用PANDAseq對配對的短序列進行組裝拼接，通過USEARCH v6軟件對拼接全長進行讀取比對，將所得組裝好的數據片段與核糖體數據庫項目(the Ribosomal Database Project)中具有較為典型、代表性的數據庫序列進行比對分類，使用DeeNuRP和Taxtastic對數據進行過濾與注釋；通過對患者樣本的宏基因組測序，發現樣本中存在核粒梭形桿菌(Fusobacteriumnucleatum)和假單胞菌(Pseudomonasadaceae)等，并在之后細菌培養實驗結果得到驗證.

4.2 臨床微生物耐藥診斷

臨床微生物病原學的診斷檢測具有十分重大的意義，臨床上對于微生物相關的研究與檢測需求也很大.除上文提到的復雜樣本的微生物種屬鑒定外，高通量測序還廣泛應用于微生物耐藥性(antimicrobial resistance,AMR)研究中.臨床上醫院獲得性感染的細菌用藥治療一直是醫療難點，主要是由于在長期的抗生物用藥篩選中，許多病原體通過基因突變而獲得對不同抗生素的耐藥性，給臨床治療造成了極大影響.

目前，通過高通量測序深度挖掘并組建了藥學相關的微生物組學數據庫.根據該大數據庫已經發現超過60種藥物與微生物之間存在相互作用，后期高通量測序也可持續挖掘微生物的耐藥性、微生物與藥物間的相互作用，及其與人類遺傳變異的相關性[33].

初亞男等[34]等基于焦磷酸測序技術建立了一種對幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)克拉霉素耐藥基因靶向性檢測的方法，在獲知耐藥情況的同時還可以基于454測序平臺進行半定量測定，并且可以根據半定量測定結果進行治療效果的評估.該研究中對44例臨床樣本進行了不同方法的檢測，比較了焦磷酸測序方法、快速尿素酶實驗和13C呼氣試驗的靈敏度；幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥突變主要是由于其23SrRNA基因中A2142G和A2143G兩個單核苷酸多態性(SNP)位點的突變，通過焦磷酸測序技術可以直接檢測到這兩個SNP位點的突變[34].實驗表明焦磷酸測序技術具備靈敏度高、檢測速度快、半定量的特點，為臨床診斷提供了一種供選擇的高效方法，且可以針對臨床患者對不同病原體的耐藥性情況進行分子學診斷以及耐藥情況與治療效果的半定量檢測.

現階段，通過高通量測序可以靶向檢測耐藥基因的突變，為臨床用藥提供及時的指導意見，也為患者的預后情況提供預估標準[33].同時，高通量測序還廣泛應用于與人類胃腸道菌群情況監測與重要疾病相關微生物感染的監控，例如肺纖維化和肺衰竭等[35].在高通量測序用于監測臨床長期用藥后胃腸道菌群的實時動態變化情況方面，測序平臺的高通量、高輸出、高效率對于實時監測呈現很大的臨床價值.

4.3 臨床腫瘤診治中的應用

目前，高通量測序平臺同樣被廣泛應用于臨床腫瘤學相關的研究中，針對DNA或RNA測序相關的腫瘤細胞來源或者腫瘤基因的低頻突變，以及尋找新的腫瘤靶標，呈現出很大的臨床應用價值[36].臨床腫瘤學的檢測診斷主要涉及基于高通量測序平臺的全基因組測序以及外顯子測序，其中全基因組測序在前文已有介紹，外顯子測序則是與腫瘤學緊密相關的測序技術，利用序列捕捉技術對全基因組外顯子區域DNA序列進行特異性捕捉，富集擴增后再進行高通量測序.基因外顯子序列在全基因組中是非常重要的一部分編碼序列，用于表達體內功能性或結構性蛋白，與腫瘤的發生與擴散及其預測與治療有著密不可分的聯系[37].而外顯子測序相對于全基因組測序更具有靶向性，且耗費的時間成本以及經濟成本也更低，對于檢測腫瘤細胞的低頻突變以及基因組的單核苷酸多態性、堿基插入或缺失有著很大的優勢.在癌癥預防上，高通量測序平臺可以用于腫瘤基因的突變篩查，指導癌癥的防控工作；在癌癥治療上，通過高通量測序平臺挖掘與癌癥相關的基因，不僅可以發掘與癌癥相關的診斷靶標，還可以發掘與之相關的治療靶點，為臨床提供具體的個性化用藥指導[38].

癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)重大科研項目的創立旨在繪制出一萬個腫瘤基因組景觀圖譜.科研人員主要通過高通量測序對腫瘤細胞的低頻、中頻突變進行監測與分析，目前該項目已經發現近1 000萬個與癌癥相關的基因突變，為癌癥的預測與治療提供了十分有意義的臨床參考[36].國際癌癥基因組計劃(the International Cancer Genome Consortium)利用測序及高通量突變檢測方法識別與癌癥發生發展相關的關鍵基因[39].該大規模項目有多個國家參與，已經發掘50多種不同癌癥；通過高通量測序，在基因組學、表觀遺傳學以及轉錄組學方面對超過2.5萬個癌癥基因組進行了系統性研究與分析，對癌癥的治療和預后情況預測具有重要意義.

4.4 遺傳疾病診斷檢測

高通量測序平臺的另一項較為重要的應用是遺傳性疾病的檢測診斷，主要包括遺傳病診斷、產前篩查與診斷，以及試管胚胎等植入性胚胎遺傳學診斷.研究人員對產婦進行無創產前基因檢測，然后對基因檢測異常的產婦的羊水或者臍帶血細胞進行染色體G顯帶檢測和熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)檢測，作為確診標準[40].高通量測序平臺為遺傳性疾病的診斷、新生兒疾病的早期診斷、產婦的無創檢測都提供了極大的便利，降低了智力障礙或者殘疾畸形兒童的出生率，大大減輕了家庭和社會的負擔，在遺傳性疾病的治療與預防方面呈現出很大的臨床應用價值.

史淑瓊等[41]對4 708例孕婦進行血液的采集以及核酸提取，采用新一代高通量測序技術，結合生物信息分析，得出胎兒非整倍體及性染色體的風險率，對21、18、13三體高風險及可疑性染色異常的孕婦進一步行羊膜腔穿刺術獲得染色體核型；經統計學分析，無創基因21、18、13三體檢出率均為100%，漏診率為0，假陽性率分別為0.04%(2/4 708)，0.08%(4/4 708)和0.06%(3/4 708)，陽性預測值分別為97.1%(67/69)，78.9%(15/19)和50.0%(3/6)，陰性預測值均為100%.

無創基因檢測在臨床檢測診斷中表現出巨大的優勢[42]，既減少了不必要的產前有創性檢測操作，增加了檢測診斷的靈敏性與特異性，也大大降低了有先天遺傳病兒童的出生率，呈現很大的臨床應用價值.

5 展 望

隨著分子生物學和科學技術的不斷提高，高通量測序技術在短短20年內獲得突飛猛進的發展.特別是“精準醫療”概念的提出，使高通量測序技術成為精準醫療的重要技術保障.盡管如此，高通量測序平臺依然存在許多亟待改進和完善之處：1) 二代測序平臺序列讀長較短，且依賴于PCR擴增技術，容易造成讀取序列的誤差與偏好性，給后期生物信息學數據分析處理造成了較大的困難，為了增加測序的準確性，無疑會增加測序的時間成本以及經濟成本，因此二代測序平臺在后期需要提高序列的讀長和精準性[43].2) 對于高通量測序平臺，數據的分析處理是至關重要的步驟[44]，目前測序市場上較為主流的Illumina和Nanopore測序平臺等都有著各自個性化處理分析數據的標準流程，因此高通量測序平臺對于實驗人員的生物信息學基礎有著十分高的要求；且由于數據處理分析方式的不同有時會產生不同的比對結果，往往沒有一個“金標準”來進行校正與比較，所以后期需要進一步完善與改進數據分析處理的能力，提高平臺的相對靈敏性與特異性，進一步構建相對準確與嚴格的標準化流程，提升平臺的穩定性.3) 二代測序平臺測序時間一般較長，主要時間消耗在準備樣品、構建文庫以及測序分析上，相對較長的測序時間對于急性傳染病暴發的監控、臨床樣本的診斷鑒定，尤其是高危患者的病原學鑒定是極大的障礙.針對這一問題，三代測序平臺的出現盡管大大縮短了測序時間，然而由于三代測序平臺在準確性上比二代測序平臺低，在廣泛實際應用中依然存在障礙.總之，未來高通量測序平臺還需要進一步縮短二代測序平臺構建文庫的時間并提高三代測序平臺的準確性.

盡管高通量測序平臺面臨著十分巨大的挑戰，在實際應用過程中依然存在許多問題，然而高通量測序在臨床微生物病原學檢測、感染相關病原體的診斷、腫瘤學研究、白血病等重大疾病診斷以及遺傳性疾病的檢測等方面都已發揮了很大的作用，也為相關學科研究提供了新的思路與技術，有望在更多領域呈現更大的臨床與研究價值.