多庫酯鈉與人血清蛋白的非共價相互作用

杜 超，林榮坤，杭 緯

(廈門大學化學化工學院，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，福建 廈門 361005)

蛋白質是生命活動的執行者，它們可以結合多種類型的配體，如脂肪酸、金屬離子、藥物和表面活性劑等.其中，蛋白質-表面活性劑復合物不僅在化妝品研發、食品安全以及藥物在人體內的轉運等領域中有著重要的應用，而且它還可以模擬人體內的生物系統.多庫酯鈉(docusate sodium，DSS)不僅被廣泛地用作食品添加劑、藥物中間體、有機溶劑等，還可以作為藥物治療慢性便秘[1].此外，DSS是一種硫酸化表面活性劑，可以通過破壞病毒包膜和使蛋白質變性來滅活單純皰疹病毒，從而防止性傳播感染[2].人血清蛋白(human serum albumin，HSA)是人體內循環系統的主要蛋白質成分.HSA含有大量可電離的氨基酸因而具有相對較高的水溶性.HSA不僅可以作為藥物分子的載體，還可以維持正常的血壓和結合許多不同類型的兩性分子，其形態在活細胞中可調節特定的細胞功能.因此，研究DSS和HSA之間的非共價相互作用具有非常重要的實際意義.

過去研究的小分子僅局限于藥物或表面活性劑中的一類性質，而同時具備藥物和表面活性劑性質的小分子尚未被報道過[3].分析蛋白質與小分子之間非共價相互作用的最常用方法是光譜法，其具有靈敏度高、選擇性強、獲取信息豐富等優點，但不能提供蛋白質-配體復合物的化學計量比關系[4-5].作為一種軟電離源，電噴霧電離可以保持蛋白質-配體復合物結構的完整性，并具有直接測量蛋白質-配體復合物化學計量比的優勢.因此，本研究通過電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)結合熒光光譜、紫外-可見吸收光譜和圓二色譜(circular dichroism,CD)系統地分析了DSS與HSA之間相互作用的化學計量比、結合常數、作用力類型以及DSS對HSA二級結構的影響，以期為闡明DSS在人體內的轉運及進一步研究其相關活性功能奠定基礎，并在分子水平上為理解表面活性劑與蛋白質相互作用機理提供理論參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電噴霧四級桿飛行時間質譜儀(Micro Q-TOF impact Ⅱ，德國布魯克公司),熒光分光光度計(F-7000，日本日立公司),紫外-可見分光光度計(UV-2550，日本島津公司),多功能手性光譜儀(MOS-500，法國Bio-Logic公司)；HSA(純度大于99%，北京謹明生物科技有限公司)，DSS(純度99%，成都化夏化學試劑有限公司)，乙酸銨(NH4Ac，純度99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，實驗用水均為Milli-Q超純水.

1.2 實驗方法

1.2.1 ESI-MS

取1.0 mL 100 μmol/L的HSA溶液于10 mL比色管中，分別加入不同體積的100 μmol/L DSS溶液，再用10 mmol/L的NH4Ac緩沖溶液(pH 7.0)定容到10 mL(HSA的最終濃度為10 μmol/L)，并在37 ℃下水浴反應30 min.分別將待測溶液通過注射泵以3.0 μL/min 的速率注入到ESI-MS儀中，并采集質荷比范圍為800～3 500的質譜信號.正離子模式下的最佳測試條件為：毛細管電壓-3.5 kV，霧化器壓力40 kPa，脫溶劑氣流速率4 L/min，去溶劑溫度180 ℃.

1.2.2 熒光光譜

取2.0 mL 10 μmol/L的HSA溶液于10 mL比色管中，分別加入不同體積的100 μmol/L DSS溶液，再用10 mmol/L的NH4Ac緩沖溶液(pH 7.0)定容到10 mL(HSA的最終濃度為2.0 μmol/L)，并分別在25，35和45 ℃下避光水浴反應30 min后，立即進行熒光測量.測試條件為：激發波長為295 nm，激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，光電倍增管的工作電壓為700 V，熒光發射光譜收集的范圍為300～460 nm.

1.2.3 紫外-可見吸收光譜

將1.0 μmol/L的HSA以及含有不同濃度的DSS的反應混合溶液，分別以NH4Ac緩沖溶液為參比進行分析.測試條件為：石英池厚度1.0 cm，狹縫寬度2.0 nm，掃描范圍200～350 nm.

1.2.4 CD

將1.0 μmol/L的HSA以及含有不同濃度的DSS的反應混合溶液分別進行測試.測定條件為：石英樣品池光程0.3 cm，掃描速度200 nm/min，掃描范圍200～250 nm.最終采集的CD譜圖為25 ℃下扣除溶液空白背景的3次掃描所取得的平均結果.HSA的二級結構分析使用儀器自帶的Dicroprot軟件進行.

2 結果與討論

2.1 ESI-MS分析

當蛋白質-配體復合物通過軟電離源被離子化時，其非共價結構可以在氣相中得以保持[6].因此，ESI-MS可用于研究小分子與蛋白質的非共價相互作用.濃度為10 μmol/L的HSA在10 mmol/L的NH4Ac緩沖溶液中的ESI-MS譜圖如圖1(a)所示.此時測得HSA的分子質量為66.54 ku,與理論值一致；并選取HSA中4個較強的多電荷質譜峰(37+～40+)進行DSS與HSA的相互作用分析.HSA與DSS摩爾比為1∶1時的ESI-MS譜圖如圖1(b)所示,可以發現4個多電荷質譜峰發生了偏移，這是因為DSS結合到HSA上，形成了HSA-DSS復合物，分子質量增加，所以導致質荷比m/z發生了偏移[7].

P和L分別表示蛋白質HSA和配體DSS，下同.

在ESI-MS譜圖中，質譜峰的電荷數和結合的配體個數遵循方程[7]：m/z=(mHSA+jmDSS+imH)/i，其中mHSA和mDSS分別為蛋白質HSA和配體DSS的分子質量，j為HSA上結合的DSS分子數，mH為H原子的質量，i為HSA在電噴霧過程中所帶的電荷數.HSA與DSS摩爾比為1∶3時的ESI-MS譜圖如圖2(a)所示.此時ESI-MS的去卷積結果表明，多電荷質譜峰(40+)中P+L的質荷比與前后兩個質譜峰(P與P+2L)之間的質荷比差值分別為10.53 和10.51，它們與電荷數(40+)的乘積為HSA上結合的DSS的分子質量.HSA與DSS摩爾比為1∶6 時的ESI-MS譜圖如圖2(b)所示，此時檢測到每個HSA分子上最多可以結合3個DSS分子.在較高的DSS濃度下(HSA與DSS摩爾比為1∶8時)，檢測到每個HSA分子上結合的DSS分子數不會繼續增加.此外，隨著DSS濃度不斷增加,蛋白質-配體復合物的質譜峰不斷偏離基線，且強度不斷下降，這是因為DSS作為陰離子表面活性劑會嚴重抑制蛋白質-配體復合物的信號[8].ESI-MS結果表明DSS與HSA兩者之間形成了穩定的HSA-DSS復合物，并且在適當的實驗條件下這種結合可以在氣相中得以維持[9].

圖2 HSA與DSS摩爾比分別為1∶3(a)和1∶6(b)時的ESI-MS譜圖

2.2 熒光光譜分析

蛋白質具有內源熒光，主要是由色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基所致，其中，Trp是主要的內源熒光源，并且對局部環境高度敏感.在HSA中僅包含一個Trp殘基，即蛋白質內部的Trp214.可以使用295 nm的激發波長來消除Tyr和Phe的熒光干擾，以獲取有關Trp殘基的信息[10].不同DSS濃度下的HSA熒光發射光譜如圖3所示，可以發現熒光強度隨DSS濃度的增加而增強，同時還伴隨著最大發射波長從334.4 nm藍移到313.2 nm，并且藍移程度隨著DSS濃度的增加而增強，然后在高濃度下達到恒定.這種熒光增強現象稱為熒光增敏作用，通常在生物大分子與某些配體共存時發生[11]；而最大發射波長藍移表明DSS的加入使得HSA中的Trp殘基周圍微環境的疏水性增強，極性降低，從而導致HSA腔內疏水結構變得更緊密，肽鏈伸展程度減小，因此推測HSA的構象發生了改變；此外藍移還體現了HSA從天然蛋白質分子向HSA-DSS復合物轉移的程度；最大發射波長值恒定不變表明DSS不再與HSA發生結合[12].

HSA濃度為2.0 μmol/L，a到k對應的DSS濃度分別為0,2,4,6,8,10,12,15,20,25,30 μmol/L.

熒光增強遵循方程[13]:1/(F-F0)=1/ΔFmax+1/(KcDSSΔFmax)，其中，F為加入DSS后的熒光強度，F0為未加入DSS時的熒光強度，ΔFmax=F∞-F0(F∞為HSA與DSS相互作用達到飽和時的熒光強度)，K為HSA與DSS的結合常數，cDSS為DSS的濃度.圖4(a)顯示了不同溫度(25，35和45 ℃)下的方程擬合曲線，從曲線的斜率和截距可以計算出不同溫度下HSA與DSS的結合常數，相關結果列于表1.從表1可知，HSA與DSS的結合常數K>105L/mol，表明二者之間具有很強的結合力；并且HSA-DSS復合物的穩定性隨著溫度升高而降低.

表1 不同溫度下HSA-DSS體系的結合常數以及相關熱力學參數

通常，蛋白質與小分子之間相互結合的非共價作用力包括范德華力、靜電作用力、氫鍵和疏水作用力.為了確定HSA和DSS之間的作用力類型，需要計算HSA與DSS反應的相關熱力學參數，例如焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG).ΔS和ΔH遵循vant’Hoff方程[14]：lnK=-ΔH/RT+ΔS/R，其中R為氣體常數，其方程擬合曲線如圖4(b)所示，計算得ΔH=-16.62 kJ/mol,ΔS=46.58 J/(mol·K).ΔG遵循方程：ΔG=ΔH-TΔS.ΔG和ΔH均小于零，表明HSA-DSS復合物的形成是一個自發的放熱過程.根據Ross等[15]和Subramanian等[16]研究小分子與蛋白質相互作用時總結的規律可知，ΔS大于零時,可作為疏水作用力的標志；ΔS與ΔH均小于零時，可作為氫鍵和范德華力的標志；ΔS大于零且ΔH小于零時為水溶液中離子之間的特定靜電相互作用的特征.在HSA中具有兩個相反類型(即疏水基團和極性基團)的主要結合位點，可以結合多種類型的化合物[17].第一個結合位點“Sudlow’s Site Ⅰ”位于子域ⅡA中，可以形成由帶正電荷的氨基酸殘基所包圍的疏水腔，并且Trp214殘基就位于其中；第二個結合位點“Sudlow’s Site Ⅱ”位于子域ⅢA中，比第一個結合位點要小.DSS具有兩條疏水鏈，可以為HSA提供較強的疏水性環境，并且DSS在水溶液中完全電離.綜上所述，判斷DSS可以通過疏水作用力和靜電作用力結合到HSA子域ⅡA的疏水口袋內[7,17].

圖4 不同溫度下1/(F-F0)對cDSS-1(a)和ln K對T-1(b)的擬合曲線

2.3 紫外-可見吸收光譜分析

不同DSS濃度下的紫外-可見吸收光譜如圖5所示.由于蛋白質骨架的π-π*躍遷，HSA在200～230 nm處有一個很強的吸收峰,并且在280 nm左右出現一個較弱的特征吸收帶，這是由氨基酸殘基(Trp、Tyr和Phe)的n-π*躍遷引起的[10].Trp和Tyr殘基的吸光度取決于其發色團的微環境，它們向波長范圍的任一側移動(即紅移或藍移)取決于周圍環境的極性[18].加入DSS后，HSA的吸光度顯著提高，發生明顯的增色效應，同時最大吸收波長值出現輕微的藍移.這是由于圍繞蛋白質殘基的極性增加，蛋白質的肽鏈延伸得更多，從而導致HSA的二級結構和周圍的微環境發生了變化[19].紫外-可見吸收光譜結果表明HSA與DSS發生了相互作用，并形成了穩定的基態復合物.

圖5 不同DSS濃度下HSA的紫外-可見吸收光譜

2.4 CD分析

圖6顯示了不同DSS濃度下HSA的CD譜圖.由于肽鍵的π-π*和n-π*躍遷，HSA的CD譜圖出現兩個負吸收帶，分別位于209和222 nm附近的紫外區域，它們是蛋白質α-螺旋結構的典型特征.在不存在DSS時，HSA的α-螺旋含量為49.9%，該結果與文獻值(50.5%)[20]基本一致.隨著DSS的濃度不斷增加，α-螺旋含量從49.9%上升至55.5%.這是由于DSS分子為HSA提供了較強的疏水性環境，增強了HSA和DSS之間的疏水作用力，從而導致HSA的α-螺旋含量增加[21].上述結果進一步證明DSS破壞了HSA的二級結構.

圖6 不同DSS濃度下HSA的CD譜圖

3 結 論

本研究運用質譜法和光譜法詳細地闡釋了DSS與HSA之間的結合特性，發現DSS對HSA的影響是多方面的.ESI-MS結果表明HSA與DSS之間可以形成化學計量比為1∶3的穩定的蛋白質-配體復合物.熒光光譜分析表明DSS對于HSA的內源熒光有增強作用，并造成熒光最大發射波長從334.4 nm藍移到313.2 nm，證明DSS的存在可以使HSA中Trp殘基周圍的極性降低，疏水性增強，從而導致蛋白質結構變得更為緊密；根據Ross定律判斷DSS可以通過疏水作用力和靜電作用力結合到HSA的子域ⅡA中的疏水口袋內.紫外-可見吸收光譜表明DSS存在時，HSA吸收峰的強度表現為明顯的增色效應且最大吸收波長產生藍移現象，進一步證明DSS與HSA之間形成了基態復合物.CD分析結果表明隨著DSS濃度增大，HSA的負峰吸收強度逐漸增強，即α-螺旋的含量增加，進一步證明DSS與HSA相互作用后導致蛋白質構象發生了變化.