脲酶誘導多步礦化原位合成CaCO3納米顆粒薄膜增強木材

易涵婧，姜 源

(廈門大學材料學院，福建 廈門 361005)

隨著航空航天、電子科技、海洋開發等現代工業的發展，人們對工程材料提出了更加嚴格的要求，新型工程材料的研究已經朝著復合化、輕質高強、多功能化、高性能化發展.近年來，隨著全球氣候變暖，溫室效應加劇，節能環保也成為了新型材料研發的重點.在工程材料的生產過程中，人們很少使用可再生能源，主要消耗化石燃料，釋放大量的CO2；這些材料不但不可再生，而且制造過程能耗高，碳排量大.木材是主要由纖維素、半纖維素和木質素構成的天然多孔復合材料，是唯一的可再生工程材料[1]；使用木材作為工程材料可以成為可持續發展戰略的踐行方案之一.作為一種古老的工程材料，盡管木材具有吸聲隔音、調濕隔熱、低密度和高強度等優異的性能[2]，但木材的絕對強度不足卻限制其繼續被廣泛地應用.因此，對木材進行改性，提升其力學性能具有重大意義.

運用綠色合成手段獲得高性能材料是可持續發展背景下的一個流行趨勢.生物礦化是一種可顯著提升力學性能的無機-有機雜化方法，在有機基質上沉積無機成分可以提升有機基質的力學強度.例如，貝殼珍珠層[3-4]的“磚塊”(扁平多邊形文石晶體)和“砂漿”(多糖和蛋白質纖維)的無機-有機組成[5]，使其具有優異的力學強度.大量的生物礦化研究表明，富含氫鍵的聚合物，如絲素蛋白、聚乙烯醇、殼聚糖、甲殼素和纖維素[6-8]可以在聚合物添加劑存在下模板礦化.借鑒生物礦化的增強策略和反應體系，利用生物礦化這樣一個綠色合成手段制備礦化木材，以形成無機-有機的有序多級結構來提升木材的力學性能.然而，三維多孔固體內部存在溶質的傳輸難題，使用傳統的仿生礦化方法會導致礦化發生在木材表面而非內部.如使用氣相擴散法時， CO2和Ca2+都是從木材外向內擴散，致使礦化主要發生在木材表面，而木材內部則由于過飽和度太低而無法成核.

脲酶(尿素酰氨基水解酶)[9]是分布在植物、細菌、真菌、藻類和無脊椎動物中的一組酶，盡管它們具有不同的蛋白質結構，但具有單一的催化功能，即水解尿素生成氨和碳酸.促進碳酸鹽的形成是脲酶的另一重要功能[10].通過增加pH和CO32-濃度，在Ca2+存在下尿素水解后會生成CaCO3沉淀[11-12].利用脲酶誘導礦化的原理可以在圓管內實現原位礦化，如He等[13]將脲酶負載在納米管內，加入尿素和Ca2+溶液，在納米管內沉淀了CaCO3礦物膜.脲酶誘導仿生礦化的方法可以將常見的雙擴散反應體系轉化為單擴散反應體系，在木材內部和表面的細胞壁上誘導原位礦化，可以避免礦化有選擇性地只發生在木材表面.

因此，本研究利用脲酶誘導仿生礦化，將傳統的雙擴散體系轉化成單擴散體系，即碳源為脲酶水解尿素原位生成提供；溶液中的Ca2+通過單向擴散進行反應，成功地在木材細胞壁上原位生成了均勻的納米顆粒狀CaCO3薄膜，制備了CaCO3/木材的無機-有機多級有序復合材料，將天然木材的抗彎強度提升了49.1%.

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

將黑龍江地區生長的速生楊木切成30 mm×2 mm×2 mm大小的木材試樣用于實驗.脲酶(提取自杰克豆，≥45 unit/mg)和乙酸購自上海阿拉丁生化技術有限公司，殼聚糖(平均重均分子質量Mw≈3.0×105g/mol，黏度800～2 000 mPa·s，脫乙酰度95%)和聚丙烯酸(PAA，Mw≈2.1×103g/mol，50%(質量分數)水溶液)購自Sigma-Aldrich，超純水(18.2 MΩ·cm)由實驗室超純水機(Smart-S15，上海和泰儀器有限公司)制得，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、無水氯化鈣(CaCl2)購自國藥集團化學試劑有限公司.除另有說明外，所有化學試劑均為分析純，無需進一步純化即可使用.

1.2 高分子層的涂覆

首先配制1%(質量分數)的乙酸溶液，再加入適量的殼聚糖粉末，使殼聚糖的質量分數為1%，磁力攪拌24 h使殼聚糖粉末完全溶解.將預處理后的木材浸泡在殼聚糖-乙酸溶液中，置于真空干燥器內，使用真空泵將真空干燥器內的大氣壓調至1 kPa并保持30 min，之后釋放真空并保持30 min，重復操作3次，使殼聚糖-乙酸溶液完全進入木材內部.然后取出木材，用去離子水清洗表面的殼聚糖-乙酸溶液，再用濾紙濾干表面殘留的水，最后放入60 ℃的鼓風烘箱中烘6 h，使殼聚糖在木材的管壁上成膜，得到殼聚糖木材備用.

1.3 脲酶的負載

將冷凍儲藏的脲酶粉末溶于去離子水中，配制2 mg/mL 的脲酶溶液(脲酶在水溶液中不穩定，久置容易降低脲酶活性，為避免實驗誤差，每次使用前需要配制新鮮的脲酶溶液).將殼聚糖處理后的木材浸泡在裝有脲酶溶液的燒杯中，再將燒杯置于真空干燥器內，使用真空泵將真空干燥器內的大氣壓調至1 kPa 并保持30 min，然后釋放真空并保持30 min，重復操作3次，使脲酶溶液完全進入木材內部.為除去木材表面的脲酶，防止木材表面發生礦化，需將木材在去離子水中漂洗10 s后取出，再用濾紙濾干表面殘留的水以備用.

1.4 鈣化溶液的制備

將Tris粉末溶于去離子水中，用1 mol/L 的HCl溶液將pH調節至7.5，制備0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液.用100 mL緩沖溶液溶解0.15 g尿素(0.17 mol/L)和0.222 g CaCl2(20 mmol/L)，然后分別加入2，20和100 μL的5%(質量分數)PAA溶液，獲得聚電解質質量分數分別為1×10-6，1×10-5和5×10-5的鈣化溶液.為使PAA與Ca2+充分混合，將溶液靜置12 h后使用.

1.5 多步礦化過程

將已涂覆殼聚糖并負載脲酶的木材放到配制好的鈣化溶液中礦化6 h，然后將木材取出用無水乙醇沖洗，放在60 ℃的鼓風烘箱中烘干.烘干后取出一部分礦化木材進行表征，剩余礦化木材重復1.3節和1.4 節的步驟進行第二輪礦化，即再依次放入新鮮配制的脲酶溶液中負載脲酶和新制備的鈣化溶液中進行第二輪礦化，循環礦化7輪后就能得到納米顆粒狀CaCO3薄膜.

1.6 測試與表征

使用萊卡公司RM2245高精度手動切片機制作木材顯微鏡樣品；采用日立公司SU-70掃描電子顯微鏡(SEM)觀察CaCO3的表面形貌，加速電壓為5 kV，表面進行噴鉑處理；使用島津公司AGS-X 5 KN電子萬能力學試驗機，根據GB/T 1936.1—2009[14]進行抗彎強度測試，每個實驗參數測試6個平行樣，測試前將樣品放在相對濕度為65%、溫度為20 ℃的恒溫恒濕箱中24 h.

2 結果與討論

2.1 脲酶誘導礦化原理

脲酶誘導礦化法可以誘導CaCO3礦物在木材細胞壁上原位生成.在仿生礦化中常用的氣相擴散法是雙擴散體系，在礦化過程中，HCO3-和Ca2+都是從木材外向內擴散，致使礦化發生在木材表面，而木材內部則由于過飽和度太低而無法成核.而本研究采用的脲酶誘導礦化法可以將雙擴散體系轉化為單擴散體系，在礦化過程中，碳源由脲酶水解尿素原位生成提供，溶液中的Ca2+通過單向擴散進行反應，可以在木材細胞壁上原位礦化.如圖1所示，本研究首先在木材細胞壁上涂覆一層殼聚糖基底.殼聚糖是一種陽離子聚合物，是用于固定脲酶的唯一天然堿性氨基多糖，可以通過吸附作用固定脲酶，并且能保證脲酶具有較高的活力[15].利用殼聚糖將脲酶固定在木材細胞壁上，然后浸漬礦化溶液將尿素和Ca2+擴散引入木材內部，尿素被脲酶催化水解后生成HCO3-[9]；通過Tris-HCl緩沖溶液的調控，使溶液的pH維持在7.5±0.3，讓脲酶保持較高的活性，在Ca2+存在下尿素水解后生成CaCO3沉淀[9]，從而誘導CaCO3礦物在木材細胞壁上原位生成.

圖1 脲酶誘導礦化生成納米顆粒狀CaCO3薄膜的示意圖

2.2 高分子基底的作用

利用高分子基底可以固定脲酶并調控礦化過程.如圖2所示，沒有加入高分子基底直接礦化，生成的是CaCO3單晶；而在加入高分子基底后礦化，則生成CaCO3薄膜.高分子基底對礦物的多晶型有著明顯的誘導效果，使用不同的高分子作基底可以調控CaCO3的晶型，且對薄膜的形成也十分重要，這與高分子基底表面的官能團種類以及相鄰官能團的間距大小有關.值得一提的是，木材的主要成分纖維素理論上也可作為不溶性模板誘導CaCO3雜化薄膜的生成.然而，在實驗中直接使用木材進行礦化反應，最終卻無法得到大面積連續的CaCO3薄膜，這歸因于木材細胞壁的結構組成：纖維素是木材細胞壁的骨架結構，在木材細胞壁表面存在的大量木質素則將纖維素包裹起來.高分子的存在能夠改變礦化過程中的結晶路線，在木材細胞壁上涂覆殼聚糖高分子后，殼聚糖上的羥基和氨基會與可溶性高分子添加劑的酸性基團相互作用，可以對CaCO3的晶型和取向進行有效的誘導；而帶負電的PAA則可以通過靜電作用吸附在殼聚糖基底上，構成受控晶體的成核位點，為Ca2+提供相互作用的位點，大大地提高了基底表面的成核位點數，從而對CaCO3的形貌起到調控作用.因此，在木材細胞壁上預先涂覆一層高分子基底再進行礦化，是生成均勻的納米顆粒狀CaCO3薄膜的關鍵之一.

圖2 高分子基底對CaCO3形貌的調控

2.3 水溶性聚電解質的作用

聚電解質PAA在水溶液中可以控制CaCO3的晶型和形貌，且其質量分數會影響CaCO3的形貌，進一步影響其力學性能.

2.3.1 對CaCO3形貌的影響

PAA的質量分數會影響CaCO3均勻成膜.在實驗中，使用不同質量分數的PAA進行礦化實驗，發現只有當PAA的質量分數處于一個適宜值時才能生成均勻的納米顆粒狀CaCO3薄膜，而當PAA的質量分數過高或者過低時均無法形成.如圖3所示：當PAA的質量分數為5.0×10-5時，看不到晶體的存在；而當PAA的質量分數為1.0×10-6，得到的是一些零碎不規則的CaCO3大塊晶體；只有當PAA的質量分數為1.0×10-5時，能生成納米顆粒狀的CaCO3薄膜.在鈣化溶液中，PAA分子鏈上的羧基可以與Ca2+結合形成絡合物，然后這些絡合物通過溶液中的擴散作用進入木材內部，再通過靜電作用吸附在殼聚糖的表面，提高成核位點附近Ca2+的過飽和度，抑制CaCO3晶體的生長速率，可以控制CaCO3晶體的礦化[16-19].雖然PAA在殼聚糖基底表面的吸附能使Ca2+和共聚體之間相互作用形成局部高濃度的Ca2+，且基底表面高濃度的無機離子可以促進CaCO3的成核和晶體生長，但是殘留在溶液中的PAA會抑制CaCO3的結晶，結晶的促進和抑制需要通過合適的PAA質量分數來進行調控.當PAA的質量分數為5.0×10-5時，因為溶液中殘留的PAA過多，顯著抑制CaCO3晶體的形成，所以在木材內部未觀察到晶體，這與Hosoda等[20]的實驗結果一致；而當PAA的質量分數為1.0×10-6，溶液中殘留的PAA太少，對結晶的抑制作用太弱，局部高濃度的Ca2+會促進CaCO3的晶體過度生長，得到的是一些零碎不規則的CaCO3大塊晶體；只有當PAA的質量分數適宜時，結晶的促進與抑制作用達到平衡，才能生成納米顆粒狀的CaCO3薄膜.因此，要形成均勻的納米顆粒狀CaCO3薄膜，聚電解質PAA的質量分數也非常重要.

圖3 PAA的質量分數對CaCO3形貌的影響

2.3.2 對力學性能的影響

PAA的質量分數在影響CaCO3形貌的同時，會進一步影響礦化木材的力學性能.經過7輪礦化后對礦化木材進行抗彎強度測試，如圖4所示：當PAA的質量分數分別為1.0×10-6，1.0×10-5和5.0×10-5時，礦化木材的抗彎強度分別為(78.0±3.7) MPa，(82.0±3.8) MPa和(55.0±5.1) MPa.這表明當木材細胞壁上未生成CaCO3時，反應后的礦化木材的抗彎強度與天然木材的抗彎強度((55.0±3.9) MPa)接近，此時礦化無法增強天然木材的抗彎強度；當木材細胞壁上有CaCO3生成時，礦物可以增強木材細胞壁，在受到外力作用時，礦物可以與細胞壁一起抵抗外力形變，進一步提升木材的抗彎強度，且當PAA的質量分數為1.0×10-5時力學性能最好，與天然木材相比，均勻的納米顆粒狀CaCO3薄膜將木材的抗彎強度提升了49.1%.

圖4 PAA質量分數對礦化木材力學性能的影響

2.4 礦化輪數的影響

使用切片機對礦化木材進行縱向切割，通過SEM對多步礦化過程進行觀察.如圖5所示，隨著礦化反應的逐輪進行，CaCO3顆粒逐漸長大且越來越密.多步礦化過程揭示了在水不溶性高分子殼聚糖和水溶性聚電解質PAA的存在下在木材細胞壁上形成納米顆粒狀CaCO3薄膜的機理.在鈣化溶液中，PAA分子鏈上的羧基可以與Ca2+結合形成PAA-Ca2+絡合物，然后這些絡合物通過溶液的擴散作用進入木材內部.木材細胞壁上涂覆了殼聚糖高分子，PAA中的部分氫鍵通過與殼聚糖上羥基的靜電作用吸附在殼聚糖的表面，提高成核位點附近Ca2+的過飽和度，使CaCO3能在殼聚糖基底上成核；隨著新鮮脲酶和礦化溶液的注入，即礦化反應的逐輪進行，木材內部繼續發生礦化反應，CaCO3在高分子基底未成核的位置上繼續成核，而已經成核的CaCO3則會結晶生長；隨著礦化輪數的增多，晶體進一步長大，晶體密度逐漸增大，最后堆積成納米顆粒狀的CaCO3薄膜.

圖5 多步礦化生成納米顆粒狀CaCO3薄膜的SEM圖

使用2 mg/mL的脲酶分別誘導木材礦化1，3，5，7，9輪后進行抗彎強度測試.從圖6可以看出，隨著礦化輪數的增多，礦化木材的抗彎強度逐漸增大，經過7輪礦化后木材的抗彎強度最高，達到(82.0±3.8)MPa，與天然楊木的(55.0±3.9) MPa相比，該礦化方法能將木材的抗彎強度提升至天然木材的1.5倍左右.這是因為隨著多步礦化的逐輪進行，礦化輪數的增多使木材內填充的礦物越來越多，晶體密度逐漸增大，細胞壁上的CaCO3層越來越厚，最后堆積成納米顆粒狀的CaCO3薄膜，使木材的力學性能明顯提高.而對天然木材進行9輪礦化后，木材的抗彎強度比7輪礦化的略低.這是由于細胞壁上已有的CaCO3逐漸堵塞了紋孔(木材內水分交換的通道)，CaCO3無法進入木材內部進行礦化，導致礦化僅在木材外表面堆積.隨著礦化木材的宏觀體積增大，當其承載的最大負荷不再變化時，抗彎強度隨之減小.因此認為進行7輪礦化反應為該實驗的最佳參數.

圖6 礦化輪數對礦化木材力學性能的影響

近年來，增強木材的方法很多(表1)，如使用松香[21]、三聚氰胺[22]、甲基丙烯酸甲酯(MMA)[23]、聚氨酯(PU)[24]等有機物浸漬改性可以將木材的抗彎強度提升12.8%～28.9%；與浸漬有機物相比，無機礦物的加入能更明顯地提升木材的力學性能，如硅酸鈉[25]、SiO2[26]等能將木材的抗彎強度提升67.7%～77.2%；與浸漬增強的方法相比，原位生成的方法由于與木材的結合力更好而表現出更優異的力學性能，如MMA浸漬加熱法[23](18.7%)與原位聚合MMA法[27](45.5%).

表1 木材增強方法對比

綜上所述，本研究利用脲酶誘導仿生礦化成功地在木材細胞壁上原位生成了均勻的納米顆粒狀CaCO3薄膜.水不溶性高分子基底和水溶性聚電解質可以協同調控CaCO3的形貌和晶型；聚電解質的質量分數對形成均勻的CaCO3薄膜非常重要，聚電解質PAA的最佳質量分數為1.0×10-5；礦化的輪數是力學性能提升的關鍵因素，進行7輪礦化后抗彎強度最高，約為天然木材的1.5倍.

3 結 論

本研究通過脲酶誘導木材仿生礦化，在木材細胞壁上生成納米顆粒狀的CaCO3薄膜，制備了CaCO3/木材的無機-有機多級有序復合材料，提高了天然木材的力學性能.利用脲酶催化水解尿素提供碳源來作為整個礦化的觸發反應，將常見的雙擴散反應體系轉化為單擴散反應體系，可以解決多孔固體礦化的擴散問題；在木材細胞壁上涂覆一層不溶性高分子基底(殼聚糖)誘導原位礦化的發生，并在陰離子型聚電解質PAA存在的條件下，有效調控CaCO3的結晶速率和動力學過程，在管壁上形成均勻覆蓋的礦物膜結構；通過多步礦化過程提升晶體密度，形成納米顆粒狀CaCO3薄膜，將木材的抗彎強度提升至天然木材的1.5倍左右.