柑桔黃龍病菌的重組酶聚合酶擴增(RPA)檢測

段 玉，馬志敏，許建建，賓 羽，宋 震，周常勇

(西南大學柑桔研究所/中國農業科學院柑桔研究所，重慶，400712)

柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)最先由澤田兼吉[1]報道在我國臺北發生，1919年Reinking[2]報道該病在我國廣東潮州亦有發生，迄今已有百余年發生史。柑桔黃龍病病原為韌皮部桿菌，屬革蘭氏陰性細菌(CandidatusLiberibacter)[3]，在田間自然傳播主要通過媒介——亞洲柑桔木虱(DiaphorinacitriKuwayama)[4]進行，能為害幾乎所有的柑桔種類。柑桔黃龍病的病原目前仍不能分離純培養，植株染病后也無有效治療藥劑，其有效防控手段為及時清除病樹、種植無病苗木和集中大面積防治傳播媒介[5]。因此，通過建立快速簡便的黃龍病菌檢測方法，實現黃龍病的早發現、早診斷，對該病的防控具有重要意義。

針對柑桔黃龍病菌，研究人員已建立了多種分子檢測方法，如利用黃龍病菌16 S rRNA、β-操縱子(rplKAJL-rpoBC)和外膜蛋白(omp)基因等保守基因序列設計特異性引物建立了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)[6]、Nested-PCR[7]、實時熒光PCR[8]、數字PCR[9]等檢測方法。這些檢測方法除對儀器要求高和耗時長外，對操作者也有一定的技術要求。環介導等溫擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)突破了儀器障礙[10]，但探針和6對引物的設計較復雜。近年來，一種新型的等溫核酸擴增技術——重組酶聚合酶恒溫擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，因具備快速、靈敏、操作簡便的特點而受到關注，并且已經廣泛應用于動植物的病害檢測，如產單核細胞李氏桿菌的RPA-LF[11]、小腸結膜炎耶爾森氏菌的實時熒光RPA[12]。

柑桔黃龍病菌的RPA熒光檢測技術也已建立[13]，其在對柑桔核酸進行粗提取后，運用重組聚合酶對目的基因片段進行恒溫快速擴增，加入稀釋后的熒光試劑在15 min內完成可視化檢測。然而，本實驗室在運用該方法的過程中發現，其效果不佳，具體表現為：健康對照和水對照背景熒光強烈；當黃龍病菌的核酸濃度較低時，在熒光判定上會出現檢測人員的主觀偏差；為避免粗提取的DNA被降解，在核酸粗提取過程中需要操作連貫迅速，對試驗技術的要求較高。因此，該方法有進一步優化的必要。

本研究根據黃龍病菌株psy62全基因組的保守基因序列設計引物，建立黃龍病菌的RPA快速檢測法，避免了檢測判斷偏差問題，同時兼顧了檢測速度、檢測靈敏度和操作簡便性。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑及儀器樣品材料：柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)、柑桔黃化脈明病毒(Citrusyellowveinclearingvirus，CYVCV)、柑桔裂皮類病毒(Citrusexocortisviroid，CEVd)、柑桔碎葉病毒(Citrustatterleafvirus，CTLV)和溫州蜜柑萎縮病毒(Satsumadwarfvirus，SDV)材料由西南大學柑桔研究所提供，柑桔潰瘍病(病原Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)材料來自于重慶的柑桔送檢樣品，柑桔黃龍病(病原CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas)疑似樣品分別來自云南、四川、廣西和江西贛州等地的柑桔送檢枝葉。

主要試劑：Biospin全能型植物基因組DNA提取試劑盒；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR MasterMix，購自Novoprotein；GoTaq?qPCR Master Mix，購自Promega；英國TwistDx Inc公司的重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)試劑盒；其余試劑均為分析純。

1.2 引物設計根據黃龍病菌株psy62全基因組中的單拷貝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷貝核糖核苷酸還原酶β亞基基因(ribonucleotide-diphosphatereductasesubunitbeta，nrdB)序列(NC_012985.3)，通過Premier 5.0軟件分別設計了2對和3對引物(見表1)。設計引物時退火溫度寬泛，避免發生錯配、二聚體和發卡結構，引物長度在30～35 bp之間，擴增產物在130～180 bp之間。

1.3 陽性樣品制備取50 mg疑似黃龍病柑桔樣品，按照DNA提取試劑盒的說明書提取總核酸，用OI1/OI2c引物進行檢驗，將陽性樣品核酸保存于-20 ℃備用。

1.4 特異性引物篩選RPA檢測體系：模板核酸2.5 μL，上下游引物各2.4 μL，primer-free rehydration buffer 29.5 μL，加無酶水補足47.5 μL，充分混勻；加入280 mmol/L醋酸鎂(MgOAc)2.5 μL，充分振蕩混勻，瞬時離心10 s，39 ℃ 20 min；加入上述反應體系等體積的三氯甲烷，充分混勻，離心2 min；吸取10 μL上清產物，用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。將設計的5對引物按照RPA檢測體系進行篩選。

1.5 檢測特異性評價根據RNA提取試劑盒的說明提取CTV、CYVCV、CEVd、CTLV和SDV侵染植株的核酸，根據DNA提取試劑盒提取Xcc和CLas侵染植株的總核酸，用“1.4”建立的RPA方法進行檢測，評價檢測特異性。

1.6 RPA產物序列分析將檢測為黃龍病菌陽性的RPA反應產物進行測序，由華大基因公司完成。將測序結果與NCBI中隨機選取的6個黃龍病菌株的相應基因序列進行比對分析。

1.7 檢測靈敏度評價選取黃龍病菌陽性樣品的核酸為模板，按10倍梯度稀釋，分別采用試驗建立的RPA、普通PCR及實時熒光PCR檢測方法進行平行檢測，比較檢測靈敏度。RPA檢測體系參考“1.4”中的檢測體系。普通PCR引物OI1/OI2c及檢測體系參考Jagoueix等[6]，略有改動：核酸2 μL，10 μmol/L的OI1和OI2c各0.3 μL，2 × Taq PCR Master Mix 5 μL，加無酶水補足10 μL。94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 10 min，12 ℃保存。

實時熒光定量PCR引物HLBas/HLBr及體系參考鐘晰[9]的實時PCR體系，略有改動：核酸2 μL，GoTaqμqPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的HLBas/HLBr各0.4 μL，加無酶水補足20 μL。95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，熒光收集15 s，35個循環。

1.8 田間樣品檢測驗證來自四川、云南、江西和廣西等地的柑桔送檢樣品共87份，品種類型包括沃柑、愛媛38(紅美人)、春見、尤力克檸檬和一些未標明品種的雜柑、甜橙和柚。根據DNA提取試劑盒提取上述樣品總核酸，采取“1.7”的反應體系同時進行RPA、PCR和實時熒光PCR檢測，統計比較不同檢測方法的黃龍病菌檢出率。

2 結果與分析

2.1 RPA引物篩選以黃龍病菌陽性核酸為模板，并設立健康對照和水對照，用設計的5對引物按照“1.4”的體系進行RPA擴增。結果顯示，引物對RPAHF2/RPAHR2和RPAHF5/RPAHR5均能從所有陽性樣品中擴增出單一特異條帶，RPAHF1/RPAHR1和RPAHF4/RPAHR4僅能從1個陽性樣品中擴增出目標條帶，RPAHF3/RPAHR3無擴增條帶，清水和健康對照無目標條帶(圖1)。故選擇引物對RPAHF2/RPAHR2和RPAHF5/RPAHR5分別進行后續試驗。

注：M：100 bp標準分子量；M1：2 000 bp標準分子量；1～2：黃龍病菌陽性核酸；3：健康對照；4：水對照。圖1 供試5對引物用于柑桔黃龍病菌陽性核酸RPA的電泳結果

2.2 RPA檢測體系的特異性評價利用引物對RPAHF2/RPAHR2和RPAHF5/RPAHR5分別對Xcc、CEVd、CTLV、CYVCV、CTV、SDV和CLas的陽性核酸樣品進行RPA檢測。電泳結果顯示，引物對RPAHF5/RPAHR5能特異性檢出CLas，而其他柑桔病原物(Xcc、CEVd、CTLV、CYVCV、CTV和SDV)樣品檢測呈陰性；引物對RPAHF2/RPAHR2在CEVd、CYVCV和SDV處有非特異條帶(圖2)。因此，引物對RPAHF5/RPAHR5的特異性較好，用于后續的黃龍病菌檢測。

注：M：100 bp標準分子量；1：柑桔潰瘍病；2：柑桔裂皮類病毒；3：柑桔碎葉病毒；4：柑桔黃化脈明病毒；5：柑桔衰退病毒;6：溫州蜜柑萎縮病毒;7：柑桔黃龍病；8：水對照。圖2 RPA檢測體系的特異性評價

2.3 RPA擴增產物序列分析將采用RPAHF5/RPAHR5進行RPA擴增出的產物，經電泳分離和切膠純化，送公司測序。結果表明，RPA產物為145 bp，與目標片段大小吻合。將所獲序列與在NCBI中隨機選取的6個黃龍病菌株的相應序列(A4，CP010804.2；AHCA1，CP029348.1；JXGC，CP019958.1；Ishi-1 DNA，AP014595.1；gxpsy，CP004005.1；psy62，CP001677.5)進行比對的結果表明，本試驗所擴增序列與其他6個序列的同源性為99.31%，為黃龍病菌(CLas)的目標序列(見圖3)。

圖3 基于RPAHF5/RPAHR5的RPA產物序列與NCBI中多個黃龍病菌株基因序列的比較

2.4 RPA靈敏度檢驗將柑桔黃龍病陽性樣品HLB-1核酸進行梯度稀釋，通過普通PCR檢測，選取稀釋29倍的HLB-1核酸，經檢測其濃度為1.8×102μg/μL。以上述濃度的HLB-1核酸為模板，10倍梯度稀釋后開展檢測的結果表明，RPA可檢測的最低核酸濃度為1.8×10-3μg/μL(見圖4中)，與實時熒光PCR相同(見圖4右)，普通PCR可檢測的最低核酸濃度為1.8×10-1μg/μL(見圖4左)。可見，RPA與實時PCR的檢測靈敏度相同，均為普通PCR檢測靈敏度的100倍。

注：圖左：PCR檢測；圖中：RPA檢測；圖右：實時熒光PCR檢測；M左：2 000 bp標準分子量；M中：100 bp標準分子量；1～6：濃度為1.8×102 μg/μL黃龍病陽性核酸按10倍數梯度稀釋后的核酸模板;坐標軸橫軸：實時熒光PCR的循環數;曲線標注為黃龍病菌亞洲種核酸的濃度。圖4 RPA檢測體系的靈敏度

2.5 田間樣品檢測驗證將來自四川、云南、江西和廣西的87份疑似黃龍病樣品提取核酸后，采用RPA、實時熒光PCR和普通PCR 3種方法進行平行檢測。結果表明，不同來源地的樣品，RPA和實時PCR檢測結果一一對應，而普通PCR存在漏檢現象(見表2)。可見，建立的RPA檢測方法穩定可靠，靈敏高效。

表2 來自不同產地的柑桔樣品采用不同方法進行黃龍病檢測的結果

3 討論

快速準確檢測柑桔黃龍病，是該病田間防控和實驗室研究的基礎。黃龍病RPA熒光檢測技術[13]實現了柑桔黃龍病的田間檢測的可視化，但在健康對照和水對照上存在較強的背景熒光信號，在對陰性和柑桔黃龍病含量較低樣品檢測時，存在受檢驗者主觀判斷偏差影響。本研究建立的RPA檢測方法，檢測結果清晰明確，對黃龍病菌含量較低的樣品也能精準檢測，很好的避免了檢測人員主觀判斷偏差的問題；與目前黃龍病菌檢測普遍使用的普通PCR法和實時熒光PCR法相比，耗時短，操作簡單，不需要精密儀器，并且檢測特異性強，靈敏度和實時熒光PCR相當(比普通PCR高100倍)；與恒溫檢測黃龍病菌的環介導等溫擴增(LAMP)法相比，RPA法更省時，反應溫度更低，引物設計更為簡單。本研究建立的RPA快速檢測方法豐富了國內柑桔黃龍病菌的檢測方法。

鄭正[14]在對nrdB基因的研究中發現，nrdB是黃龍病菌基因組中拷貝數最多的基因之一。幾乎所有已經發表的黃龍病菌株(SGCA5菌株除外)的基因組上均含有5拷貝nrdB基因，且nrdB基因在柑桔黃龍病菌株的系統分類鑒定上和16S rRNA基因具有相對穩定的進化關系，可以用于該病原菌的檢測。與基于單拷貝基因設計的引物相比，基于nrdB基因設計的引物在黃龍病菌檢測上具有更高的靈敏度。本研究根據黃龍病菌基因組保守序列設計了5對引物，篩選出1對以多拷貝nrdB基因序列為靶標的特異性引物RPAHF5/RPAHR5，建立了黃龍病菌的RPA檢測方法。

在本研究中，黃龍病陽性樣品大多來自四川和云南。其中，四川18份雜柑樣品是從宜賓市送檢的356份樣品中篩選出的有明顯黃龍病癥狀的樣品，故檢出率100%，因此，不能據此認為四川黃龍病發病率高。為了更好地檢驗本研究建立的RPA檢測法的適用性，今后應進行更多地區和更多樣品的檢測。

本研究篩選的引物RPAHF5/RPAHR5對柑桔黃龍病菌(CLas)的特異性強，不會和柑桔其他6種常見病害發生非特異性反應，在田間樣品的檢測中也未發生非特異性反應現象。需要注意的是，在PCR反應中只需要幾個DNA分子做模板就可以大量擴增[15]，而RPA比普通PCR靈敏100倍，故RPA也可能帶來假陽性問題。在混勻反應液的過程中，RPA試劑盒是八連管設計，在開蓋和關蓋的過程中八連管的密封性容易降低，特別是在震蕩混勻過程中極易爆蓋而導致樣品污染。建議采用將樣品多次上下顛倒混勻后瞬時離心15 s，以取代震蕩混勻過程。這樣可有效地避免因震蕩過程中樣品管蓋子爆開導致的污染問題。

4 結論

本研究建立了基于特異性引物RPAHF5/RPAHR的黃龍病菌RPA快速檢測方法，通過特異性、靈敏度和田間樣品檢測驗證了該法具有特異性強、靈敏度高、檢測結果可靠等特點，且不需特殊儀器設備，對操作者的技術要求較低，適宜用于基層人員對黃龍病菌的快速檢測。