奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa不同分離株的生物學特性研究

余鳳玉，唐慶華，朱 輝，宋薇薇，牛曉慶，楊德潔

(中國熱帶農業科學院椰子研究所/院士團隊創新中心/椰子國家工程研究中心，海南文昌，571339)

奇異根串珠霉菌Ceratocystisparadoxa屬于根串珠霉屬，在熱帶地區分布極為廣泛，可侵染為害大部分棕櫚科植物，是影響棕櫚科植物建康發展的重要病原菌[1-2]。該菌可為害椰子CocosnuciferaL.、布迪椰子Butiacapitata(Mart.) Becc.、三角椰子Dypsisdecaryi(Jum.) Beentje & J.Dransf.、棍棒椰子HyophorbeverschaffeltiiH.Wendl.、油棕ElaeisguineensisJacq.、椰棗PhoenixdactyliferaL.等棕櫚植物，引起莖干瀉血、莖干腐爛、冠腐、芽腐、葉片焦枯、果腐等癥狀，嚴重的整株死亡[3-9]。目前，在海南省椰子種植區普遍發生由奇異根串珠霉菌為害引起的棕櫚植物病害，其中以為害椰子引起莖干瀉血和莖干腐爛最為嚴重，發病率40%以上，死亡率超過5%[8，10]；至今尚無十分有效的防治方法，給海南省椰子等棕櫚植物的生產及推廣應用造成嚴重威脅和損失，已成為棕櫚科植物生產及推廣應用急需解決的問題。

奇異根串珠霉菌為土壤習居菌，其厚垣孢子可在土壤中長期存活并廣泛傳播。自1906年首次在斯里蘭卡發現奇異根串珠霉菌引起椰子瀉血病以來，已有110多年的歷史，國內外學者在奇異根串珠霉菌引起棕櫚植物病害的發生分布[4，8-10]、化學藥劑篩選、生物防治[5，11-18]等多方面進行了卓有成效的研究，取得了積極進展。但由于不了解病原菌致病性分化情況，影響了人們對該病原菌侵染條件及為害情況的認識，制約了對該病原菌引起病害的防治、預測預報和寄主抗病性等方面的研究，至今尚未找到十分有效的奇異根串珠霉菌病害防治方法。因此，本研究對椰子樹不同部位分離到的3株菌落特征差異顯著的分離株進行其生物學特性研究，以便為研究闡明奇異根串珠霉菌致病力和遺傳多樣性，及病害防治策略制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的采集、分離

從海南省文昌市椰子樹上表現心部腐爛、莖干腐爛和樹冠基部腐爛的部位采集病樣，按常規組織塊分離法[19]分離病原菌，獲得單菌落后保存菌種，選擇在PDA培養基平板上菌落特征差異明顯的3株分離株BR2、TR924和GF924作為研究對象。

1.2 培養性狀觀察

將分離株BR2、TR924和GF924用打孔器(直徑5mm)從菌落邊緣取菌碟，無菌條件下移入PDA培養基平板中央置于25 ℃恒溫培養箱中培養，2 d后觀察記錄菌落形狀、顏色、氣味及氣生菌絲生長情況。

1.3 溫度對菌絲生長和產孢量的影響

將分離株BR2、TR924和GF924在PDA培養基上培養2 d后，用打孔器(直徑5 mm)從菌落邊緣取菌碟，無菌條件下移入PDA培養基平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃恒溫條件下培養，2 d后用十字交叉法測量菌落直徑；7 d后分別用30 mL無菌水洗滌平板，制成孢子懸浮液，然后在顯微鏡下用血球計數板計量孢子濃度。每處理重復6次。

1.4 碳氮源對菌絲生長和產孢量的影響

以查彼克培養基(Czapek)為基礎培養基，將分離株BR2、TR924和GF924置于不同碳源和氮源培養基，即分別以等量的D-果糖、甘露醇、D-半乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、海藻糖置換其中的蔗糖，以等量的硝酸鉀、脲、硫酸銨、磷酸二氫銨、硝酸銨、氯化銨置換其中的硝酸鈉，以Czapek培養基為對照，不加碳源和不加氮源為空白對照，每處理重復6次，25 ℃恒溫培養箱中培養。按照1.3的方法測量菌落直徑和計算孢子數。

1.5 pH值對菌絲生長和產孢量的影響

分別用HCl 1 mol/L和NaOH 1 mol/L溶液在無菌條件下將PDA培養基的pH值調節到4、5、6、7、8、9、10、11共8個處理，將直徑5 mm菌碟接種于不同pH值平板中央培養，25 ℃下恒溫培養，每處理重復6次。按照1.3的方法測量菌落直徑和計算孢子數。

2 結果與分析

2.1 培養性狀

分離得到的3個菌株在PDA培養基平板上生長迅速，2 d后均長滿整個培養皿(直徑90 mm)，氣生菌絲發達，有濃郁的水果香味。初期菌絲體白色，稀疏放射狀，后從中央開始隨著厚垣孢子的產生而呈黑色。生長7 d后發現存在3個菌落特征差異明顯的菌株BR2、TR924和GF924。其中分離株BR2氣生菌絲茂盛松軟，厚，棉絮狀；分離株TR924氣生菌絲茂盛，較松軟，羽絨狀；分離株GF924氣生菌絲較為致密，絨毛狀(見圖1)。

圖1 奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa3株分離株PDA培養基培養7 d后的培養性狀

2.2 溫度對菌絲生長和產孢量的影響

從圖2可以看出，分離株BR2、TR924和GF924的菌絲15～35 ℃均可以生長，30 ℃時菌絲生長速率下降。BR2和GF924最適生長溫度為25～30 ℃，TR924菌絲最適生長溫度為25 ℃。3株分離株在20～30 ℃范圍內生長速率存在差異，GF924的生長速率極顯著低于另2株分離株。

圖2 溫度對奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分離株菌絲生長和產孢量的影響

分離株BR2、TR924和GF924在10～35 ℃范圍內均可以產孢。10～25 ℃，分離株TR924和GF924產孢量均呈上升趨勢。分離株BR2在20 ℃時的產孢量顯著低于15 ℃，10～25 ℃范圍內其產孢量呈先升后降再升的趨勢；10～30 ℃范圍內BR2的產孢量均極顯著高于另外2株分離菌。

2.3 碳氮源對菌絲生長和產孢量的影響

從表1可以看出，3株分離株均可在查彼克培養基(對照)上生長，在可溶性淀粉為碳源的培養基上生長最快。3株分離株在供試培養基上均可以產孢，其中，分離株BR2和GF924在可溶性淀粉為碳源的培養基上產孢量最大，而分離株TR924在甘露醇為碳源的培養基上產孢量最大。綜合菌絲生長和產孢量可知，分離株BR2和GF924菌絲生長及產孢的最適碳源均是可溶性淀粉；分離株TR924菌絲生長最適碳源是可溶性淀粉，最適產孢碳源是甘露醇。

表1 碳氮源對奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分離株菌絲生長和產孢量的影響

分離株BR2、TR924和GF924在無氮源培養基上均能生長和產孢。供試氮源中，菌絲生長的最適氮源均為氯化銨，生長速率顯著高于其他供試氮源。分離株BR2最適產孢氮源是硝酸鉀，TR924和GF924在查彼克培養基(對照)上產孢量最大。3株分離株在脲為氮源的培養基上均不能產孢。氯化銨雖然最適合TR924菌絲生長，但卻不能使其產孢。

2.4 pH值對菌絲生長和產孢量的影響

從表3可以看出，在pH值4～11范圍內，分離株BR2、TR924和GF924均能很好地生長和產孢。其中，分離株BR2菌絲生長和產孢的最適pH值分別是5和6，產孢量達到(40.83±6.12)×107/皿；分離株TR924菌絲生長最適pH值為5～7，最適產孢pH值為6；分離株GF924菌絲生長最適pH值為6，最適產孢pH值是10～11。

表3 pH值對奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分離株菌絲生長和產孢量的影響

3 結論與討論

本文從椰子不同部位分離獲得3株奇異根串珠霉菌分離株。試驗結果表明，3株分離株菌絲在15～35 ℃范圍均可以生長，但分離株TR924在30 ℃時菌絲生長速率開始下降，說明該分離株對高溫的耐受性較差，這與其引起的海南椰子樹莖干腐爛病只在冬春季流行相吻合，說明溫度是影響椰子樹莖干腐爛病流行暴發的關鍵生態因子。研究結果表明，分離株BR2和GF924菌絲生長及產孢的最適碳源均是可溶性淀粉；分離株TR924菌絲生長最適碳源是可溶性淀粉，最適產孢碳源是甘露醇。菌絲生長的最適氮源均為氯化銨，生長速率顯著高于其他供試氮源。分離株BR2最適產孢氮源是硝酸鉀，TR924和GF924在查彼克培養基上產孢量最大。3株分離株在無氮培養基上均能生長和產孢，說明這3株分離株有高效的氮代謝途徑[20]。碳氮源是病原菌生長的基本物質，研究不同碳氮源對病原菌生長的影響，是系統研究病害發生規律的重要內容之一，對病害防控有指導意義[21-22]。3株分離株在pH值4～11的范圍內均能很好地生長和產孢，但不同分離株間存在差異。菌絲生長最適pH值均為弱酸性，而產孢對酸堿性適應性差異顯著，GF924在強堿性條件下產孢量最大，弱酸性最適合另2株分離株產孢，說明從不同部位分離獲得的分離株有性繁殖對酸堿性的適應性不一樣。奇異根串珠霉菌是土壤習居菌，土壤pH值環境影響其定殖和侵染。本文研究結果顯示奇異根串珠霉菌在pH值4～11的范圍內均能很好地生長和產孢，但對其致病力還有待進一步研究，以期通過改良土壤pH值來防控奇異根串珠霉菌引起的病害。