銅脅迫對粉葛幼苗生長及生理指標的影響

高 昆， 冀中英

(1.山西大同大學 生命科學學院,山西 大同 037009;2.山西大同大學 設施農業技術研發中心,山西 大同 037009)

銅作為植物體內的微量營養元素之一，對植物進行正常的生命活動是十分重要的[1]，銅也構成了某些金屬蛋白酶，參加植物很多的生物反應[2]，但銅過量會破壞細胞膜結構和功能，抑制植物的抗氧化物酶系統和植物的光合作用[3]，從而導致植物的生物量減少、生長發育遭到妨礙，嚴重會引起萎黃病和壞死[4]。除此之外，含量過高的銅還會對植物礦質營養元素的吸收和運輸造成一定的影響[5]。在韋美玉，熊思，董麗欣等人的研究中發現，低濃度CuSO4對芹菜、玉米幼苗、年幼的蘋果樹木的正常生長發育具有積極的影響，而高濃度CuSO4對它們會產生一定的阻礙作用，進而導致它們的質量和產量下降[6～8]。

在現今的生活中，銅的使用量越來越多，導致了銅污染物排放也越來越多，銅已經成為了影響生態環境的元素之一[9]。 根據2014年《全國土壤污染調查公報》[10]的報道顯示，銅是耕地和金屬冶煉工業園區及其周邊土壤的主要污染物[11]。一般情況下，土壤中銅的總含量為15～40 mg·kg-1，但當土壤中銅的總含量為150～400 mg·kg-1，會給植物帶來毒害作用[6]。

葛(Puerarialobata)是多年生豆科(Leguminosae)藤本植物，主要分布于熱帶和溫帶，中國擁有豐富的葛屬植物種質資源，約有9個種，2個變種，其中野葛(Puerarialobata(Willd.) Ohwi)和粉葛(Puerarialobata(Willd.) Ohwi var.thomsonii(Benth.) Vaniot der Maesen)在中國的開發應用最廣，分布也最廣[12]。葛的各部分均具有使用價值，葛的根、葉、花都可以入藥，葛根還可以被開發為保健食品；葛藤纖維可用于織物與造紙；葛葉可被用作天然的優質飼料。除此之外，葛還具有保持和改良水土的生態作用[12～13]。并且在本次新冠肺炎疫情中，葛根湯顆粒在預防以及早期治療過程中發揮了重要作用。

實驗選用的葛品種是粉葛(P.thomsoniiBenth)，它的葉呈綠色，塊根比較粗大、形狀類似長棒形或紡錘形[14]。粉葛適合生長在相對溫暖、濕潤的氣候，能抵抗一定程度的寒冷和干旱[15]。它的適應性也比較廣，病蟲害也相對較少，在大多數土壤中均可栽培，但黏土與堿性土除外[15]。粉葛的主要利用部位是根部，即葛根。葛根的地上部分含有葛根素[16], 在臨床上被大量應用，可用于治療冠心病、偏頭痛等[17]。研究表明，葛根可以使心率減慢，血壓降低[18]，還可以使腦血管擴張，改善大腦供氧[19]。除此之外，葛根也能夠使腦微循環障礙得到改善，降低血脂，調節血糖[20]。

近些年來，葛在發掘種質資源、改善栽培技術以及臨床應用等方面的研究頗多，還未見重金屬脅迫對葛幼苗生長和生理特性的影響方面的報道。本實驗研究銅脅迫時對粉葛生長及其生理指標的影響，以期為葛根安全規范種植和保證藥材的品質提供一定的理論根據。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所選用的粉葛幼苗購買于廣西藤縣綠州農業發展有限公司，所購的幼苗帶有一部分根和葉。

1.2 方法

1.2.1 粉葛幼苗的栽培 挑選粗細一致且無病蟲害的粉葛幼苗，先用自來水沖洗至潔凈，然后置于裝有常溫自來水的透明玻璃瓶中培養5 d，進行緩苗。

1.2.2 粉葛幼苗的銅脅迫 Cu2+以CuSO4·5H2O的形式提供，選取生長勢基本一致的粉葛幼苗，并將其分成5組，每組3瓶，每瓶2株，5組分別如下：

處理①——對照(不施CuSO4溶液)；

處理②——施0.01 mg·L-1CuSO4溶液；

處理③——施0.03 mg·L-1CuSO4溶液；

處理④——施0.06 mg·L-1CuSO4溶液；

處理⑤——施0.1 mg·L-1CuSO4溶液；

②～⑤組各添加100 mL上述濃度的CuSO4溶液， ①組添加100 mL的蒸餾水作為對照。每瓶上做好溶液體積的刻度標記，脅迫處理期間，若溶液體積低于刻度線，則需要及時添加適量的蒸餾水以補充損失的水分，保持銅離子濃度恒定。在銅脅迫0 d，3 d，6 d，9 d，12 d時，對5組分別取樣測定。

1.2.3 形態觀察 觀察并記錄各組粉葛幼苗銅脅迫處理12 d后葉片的形態特征，并將銅脅迫對粉葛幼苗的影響程度分為5個級別：

1級——葉尖、葉緣焦枯并有小部分葉脫落；

2級——葉尖、葉緣變黃；

3級——生長正常(無葉尖、葉緣變黃和葉片脫落現象)；

4級——小部分葉片舒展、葉色濃綠；

5級——大部分葉片舒展、葉色濃綠。

1.2.4 測定生長指標 葉長、葉寬的增長率：各組隨機選取3株幼苗，在銅脅迫0 d，3 d，12 d時，用直尺測定同一葉位同一葉片的葉長、葉寬(精確到0.1 cm)，并計算增長率(A)，計算方法按潘雪峰[21]的方法測定，方法如下：

式中，A——葉長(或葉寬)的增長率，C——銅脅迫0d時的葉長(或葉寬)，D——銅脅迫3 d，12 d的葉長(或葉寬)。

1.2.5 測定各項生理指標 各組隨機摘取粉葛幼苗長勢相近的葉片，然后測定各項生理指標。處理①～⑤各重復3次，各指標及其測定的方法如下：

(1)在銅脅迫3 d，6 d，9 d，12 d后用SPAD-502PLUS葉綠素計測定葉片銅脅迫下的SPAD值；

(2)在銅脅迫12 d后按照考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白質含量[22]；

(3)在銅脅迫12 d后采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量和可溶性糖含量[23]；

(4)在銅脅迫12 d后采用電導儀法[24]測定膜的相對透性。

1.2.6 數據處理 用SPSS 19.0進行顯著性分析，用Excel 2010進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 銅脅迫對粉葛幼苗外觀形態的影響

由表1可知，銅離子濃度不同，對粉葛幼苗生長形態的影響有所不同，其中0.01 mg·L-1和0.03 mg·L-1濃度下，粉葛幼苗葉片的外觀形態良好，而0.06 mg·L-1和0.1 mg·L-1濃度下，粉葛幼苗葉片的外觀形態與對照組相比較差。

表1 不同濃度銅離子對粉葛幼苗葉片的影響程度及葉片癥狀

2.2 銅脅迫對粉葛幼苗生長指標的影響

由圖1可知，粉葛幼苗葉片的葉長增長率表現出先升高后下降的趨勢，并且在高濃度銅離子處理的條件下，時間越長，濃度越大，葉長增長率下降越明顯，處理②～⑤組與對照組均形成極顯著差異(P<0.01)。在處理3 d時，處理③的粉葛幼苗葉片的葉長增長率達到最大值，為8.33 %，而處理⑤的葉長增長率降至最低，為6.80 %。在處理12 d時，粉葛幼苗葉片的葉長增長率在處理③和處理⑤條件下，分別達到最大和最小值，分別為8.54 %、6.67 %。當施用的銅離子濃度低于0.03 mg·L-1時，處理12 d的葉長增長率均高于3 d，而當施用的銅離子濃度高于0.03 mg·L-1時，處理12 d的葉長增長率均低于3 d。根據表2可知，處理天數和處理濃度之間存在互作，濃度的作用效果十分顯著，而天數的作用并不明顯。處理12 d并且處理濃度為0.03 mg·L-1的條件對粉葛幼苗的促進效果最明顯，而在處理12 d且外施銅離子濃度為0.1 mg·L-1時，對粉葛幼苗的抑制作用最顯著。這說明，低濃度銅離子會促進粉葛幼苗的生長，而高濃度銅離子則會抑制其生長。

圖1 不同濃度銅離子對粉葛幼苗葉長增長率的影響

表2 主體間效應的檢驗 因變量：葉長

由圖2可知，粉葛幼苗葉片的葉寬增長率呈先上升后下降的趨勢，并且在高濃度銅離子處理的條件下，時間越長，濃度越大，葉寬增長率下降并不明顯，各組與對照組均形成極顯著差異(P<0.01)。在處理3 d時，處理③的粉葛幼苗葉片的葉寬增長率達到最大值，為8.76 %，而處理⑤的葉寬增長率降至最低，為7.66 %。在處理12 d時，粉葛幼苗葉片的葉寬增長率在處理③和處理⑤條件下，分別達到最大和最小值，分別為8.83 %、7.64 %。在銅離子濃度低于0.03 mg·L-1時，處理12 d的葉寬增長率均高于3 d，而當銅離子濃度高于0.03 mg·L-1時，處理12 d的葉寬增長率與處理3 d相差不大，并無顯著差異。根據表3可知，濃度和天數之間存在互作，濃度和天數的作用效果均比較顯著。處理12 d并且處理濃度為0.03 mg·L-1的條件對粉葛幼苗的促進效果最明顯，而在處理12 d且外施銅離子濃度為0.1 mg·L-1時，對粉葛幼苗的抑制作用最顯著。這說明銅脅迫對粉葛幼苗的生長具有低促高抑的作用。

圖2 同濃度銅離子對粉葛幼苗葉寬增長率的影響

表3 主體間效應的檢驗 因變量：葉寬

2.3 銅脅迫對粉葛幼苗生理指標的影響

2.3.1 對粉葛幼苗SPAD值的影響 SPAD值能夠用來反映粉葛幼苗葉片的葉綠素含量。由圖3可知，在施用低濃度銅離子的條件下，SPAD值隨著時間的延長呈上升趨勢，而在高濃度銅離子處理條件下，SPAD值則隨著時間的增加表現出下降趨勢，并且時間越長，濃度越大，下降程度越明顯。在處理②和處理③中，時間越長，SPAD值越大，且均與對照組(處理①)形成極顯著差異(P<0.01)，處理③比處理②增加的程度更大。在處理②中，SPAD值升至最高為46.87，在處理③中，SPAD值升至最高為48.63。在處理④和處理⑤中，隨著時間的增加，SPAD值表現出下降的趨勢，并且兩個處理組均與對照呈極顯著差異(P<0.01)。在處理④中，SPAD值降至36.53，達到最小值，處理⑤中的SPAD值均低于處理④，并且最小值為33.60。根據表4可知，處理濃度和處理天數之間存在互作，并且濃度和天數的作用效果均十分顯著。在處理12 d并且處理濃度為0.03 mg·L-1的條件下，粉葛幼苗的SPAD值增幅最明顯，而在處理12 d且外施銅離子濃度為0.1 mg·L-1時，粉葛幼苗的SPAD值的降低最顯著。這說明，粉葛幼苗能抵抗一定濃度的銅脅迫，但超過一定限度后，SPAD值會出現下降，即葉綠素含量下降。

圖3 不同濃度銅離子對粉葛幼苗SPAD值的影響

表4 主體間效應的檢驗 因變量：SPAD

2.3.2 對粉葛幼苗可溶性蛋白含量的影響 由圖4可知，粉葛幼苗葉片中可溶性蛋白質的含量會隨著Cu2+濃度的增加而表現出先增加后下落的趨勢，并且與對照組形成極顯著差異(P<0.01)，處理②與處理③的增幅并沒有明顯差異。處理②～處理⑤可溶性蛋白的含量分別為16.43 mg·g-1、17.13 mg·g-1、13.90 mg·g-1、13.16 mg·g-1，并且在0.03 mg·L-1銅離子處理條件下，粉葛幼苗葉片的可溶性蛋白質含量達到最大，與對照相比升高了13.57 %，而在0.1 mg·L-1銅離子處理條件下，可溶性蛋白質含量降至最小值，比對照組降低了12.73 %。這說明，低濃度Cu2+可以提高粉葛幼苗中可溶性蛋白質的含量，而高濃度Cu2+會使粉葛幼苗中的可溶性蛋白質的含量出現下降的情況。

圖4 不同濃度銅離子對粉葛幼苗可溶性蛋白質含量的影響

2.3.3 粉葛幼苗丙二醛(MDA)、膜相對透性的變化 由圖5可知，粉葛幼苗葉片中的MDA會隨著Cu2+濃度的升高而表現上升趨勢，其中處理②、處理③與對照組之間沒有形成顯著差異(P>0.05)，處理④和處理⑤與對照組差異極顯著(P<0.01)，處理④與處理⑤之間沒有很明顯的差別。在外施的銅離子濃度為0.1 mg·L-1時，粉葛幼苗葉片的MDA含量升到最高，并且比對照組提高了31.18 %。這說明，外施銅離子會使粉葛幼苗葉片的MDA含量提高，并且銅離子濃度越大，MDA含量的提高，從一定程度上反映了細胞膜的受害程度。

圖5 不同濃度銅離子對粉葛幼苗丙二醛含量的影響

膜的透性可以用電導率來反映[33]。圖6反映出，粉葛幼苗葉片的相對電導率表現出升高的趨勢，其中處理②與對照組(處理①)之間沒有形成顯著差異(P>0.05)，處理③～④組均與對照呈極顯著差異(P<0.01)，各組之間均有明顯的差別。在處理⑤時，相對電導率上升到最大，為29.61 %，比對照組提高了181.73 %。這說明，高濃度銅離子會損傷粉葛幼苗的細胞膜。

圖6 不同濃度銅離子對粉葛幼苗相對電導率的影響

2.3.4 對粉葛幼苗糖含量的影響 從圖7可以得到，隨著銅離子濃度增大，粉葛幼苗葉片中的可溶性糖含量逐漸攀升，銅離子濃度達到0.1 mg·L-1時，增幅最明顯，處理②、處理③與對照組形成的差異并沒有那么顯著(P>0.05)，處理④與對照組形成了較為顯著的差異(P<0.05)，處理⑤則與對照組形成了極顯著差異(P<0.01)。處理②～處理⑤可溶性糖的含量分別為0.38 μmol·g-1·FW、0.40 μmol·g-1·FW、0.44 μmol·g-1·FW、0.60 μmol·g-1·FW，相對于對照組(處理①)分別增加了5.04 %、12.89 %、22.97 %、68.52 %。這說明銅離子濃度高低會影響粉葛幼苗中可溶性糖的含量。

圖7 不同濃度銅離子對粉葛幼苗可溶性糖含量的影響

3 結論與討論

重金屬的毒害作用會導致植物體內的生命活動發生混亂，從而阻礙植物的生長，嚴重會引起死亡。然而，大部分植物都會對重金屬的毒害作用表現出應激保護效應，如植物具備的細胞滲透調節機制[26]，提供重金屬離子的附著位點[4]，液泡隔離、吸收重金屬離子[4]等。銅離子在不同植物中的含量不同，粉葛中銅含量為0.03 mg·L-1[27]。

本研究發現，粉葛幼苗在低濃度銅離子條件下(0.01 mg·L-1和0.03 mg·L-1)，葉片長勢好，葉色濃綠，然而，隨著銅離子濃度的增加葉尖、葉緣逐漸變黃、焦枯，甚至有一小部分脫落死亡。除此之外，本研究還發現，隨著銅離子濃度的逐漸上升，粉葛幼苗葉片的葉長和葉寬增長率均呈現出先升后降的趨勢，這與潘雪峰[21]、趙艷[28]、周娜娜[29]等人的研究結果一致，并且在銅離子濃度達到0.03 mg·L-1時，葉長和葉寬的增長率均達到最大值。這可能是由于在低濃度銅離子處理條件下，激活了粉葛幼苗的抗逆性反應，從而促進了其葉片的生長，而高濃度的銅離子會使植物體內的代謝紊亂，從而阻礙了葉片的生長。

根據喬潤雨[30]、宋慧[31]等人的報道顯示，用SPAD值來反映不同蔬菜和甜瓜幼苗不同位置葉片的葉綠素含量是可靠的，兩者之間表現有正相關性[32]，并且方法操作簡單。本研究發現，低濃度銅離子處理條件下，SPAD值隨著時間的延長而逐漸上升，但是，在施用高濃度銅離子的情況下，SPAD值則會隨著時間的增加而逐漸下降，并且時間越長，濃度越大，下降越明顯。這說明，低濃度銅離子會促進葉綠素含量的增加，而高濃度銅離子則會降低葉綠素含量。這可能是由于銅是電子傳遞鏈中的質體藍素的組成成分[33]，并且少量的銅離子有助于葉綠素的合成。但是，銅離子不是越多越好，銅離子濃度過高一方面會引起銅離子替代葉綠素中的鎂離子，從而阻礙了葉綠素的合成，另一方面也會破壞葉綠體的結構，影響類囊體膜的組成和光系統之間的協調功能，最終妨礙了光合作用的進行[26]。

本研究發現，粉葛幼苗葉片中的可溶性蛋白質含量在低濃度銅離子條件下有所增加，而在高濃度銅離子處理條件下則顯著下降，這與朱健[34]等人的研究結果一致。表現出這種趨勢的原因可能是在粉葛幼苗體內產生了一些抵抗逆境脅迫 的蛋白，使得可溶性蛋白質含量升高。然而，銅離子的積累會阻礙蛋白質的正常合成，最終導致可溶性蛋白質的含量出現降低的情況。

膜脂過氧化作用的產物主要是MDA[35]。用電導率來反映質膜透性也是可靠的，它們之間表現有一定的正相關。因此，以上兩種方法均可以用來衡量粉葛幼苗細胞膜受銅脅迫傷害的程度。本研究發現，無論是丙二醛含量還是相對電導率都在逐漸上升，與趙淑玲[33]、馬曉華[26]等人的研究結果一致。這可能是由于銅脅迫造成粉葛幼苗細胞膜受到破壞，從而造成丙二醛含量增加，與此同時，膜的透性程度增加，引起一些電解質向胞外滲出，相對電導率也相應增大。

可溶性糖是植物在逆境條件下為保護細胞的滲透調節物質[35]。本次的研究發現，可溶性糖的含量會隨著銅離子濃度的不斷增大而逐漸升高，這可能是由于粉葛幼苗為提升細胞的滲透調節能力而采取的一種手段。綜上，銅脅迫會影響粉葛幼苗的生長及生理指標，銅離子濃度低時，會促進粉葛幼苗的生長及生理響應，而高濃度的銅離子會使葉綠素和可溶性蛋白的含量出現降低的情況，電解質也易向胞外滲出，同時產生了MDA和可溶性糖，從而阻礙了粉葛幼苗的正常生長發育。