丹參醇提物的抗菌作用研究

陳 穎

(商洛學院 健康管理學院，陜西 商洛 726000)

丹參是唇形科鼠尾草屬，其藥用部位為干燥根及根莖。其味苦，微寒，歸心、肝經。具活血祛瘀、清心除煩、涼血消癰和通經止痛等作用[1]。丹參作為我國常用大宗藥材之一，在治療心血管疾病方面作用顯著[2]。丹參的脂溶性成分大多為共軛醌、酮類化合物，主要包括：隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡB，丹參酮ⅡA，等。其中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的含量較高[3]，其脂溶性丹參酮類具有抗菌、血液循環及消炎等作用[4]，并且隱丹參酮是丹參抗菌的主要有效成分。

近幾年來，細菌耐藥性問題層出不窮，嚴重影響大家的身體健康。雖然有很多科學家投身于解決細菌耐藥性的問題，但還沒有發現一個從根本上能夠解決細菌耐藥性問題的方法[5]。隨著對細菌耐藥性的深入研究，人們發現可從天然產物途徑來發現能抗菌的成分[6]，特別是從一些藥用植物中探索能夠抑制抗生素耐藥菌的化合物[7]。又有研究發現，細菌不容易對中草藥產生耐藥性，而且我們國家自古以來就擁有十分豐富中草藥資源[8]。由此可看，從中藥中提取新型抑菌劑，或者與抗生素聯合使用，具有廣泛的應用前景和臨床研究價值。

1 材料與方法

1.1 丹參醇溶性成分的提取

將丹參的干燥根及根莖，粉碎，過60目篩，稱取100 g，倒入1 000 mL燒杯中，加入500 mL無水乙醇，超聲提取60 min，提取液抽濾。將濾液放入旋轉蒸發儀中蒸發，至旋干后，倒入一定量的無水乙醇將丹參的醇溶性成分溶解完全，移至帶蓋小試管中，計算其濃度。密封保存待用。

1.2 丹參醇提物對細菌的生物量影響

首先，在50 mL的具塞試管中加入40 mL的液體培養基，再加入不同濃度的提取液，使提取物的最終濃度為0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.125、0.25、0.4、0.5 mg·mL-1，每瓶接入4 mm直徑菌餅兩塊。然后在振蕩器中37℃震蕩培養，每個濃度重復兩遍。震蕩培養7 d后抽濾收集菌絲體，用蒸餾水沖洗3次，稱量菌體濕重。然后將菌絲置于80 ℃烘箱中干燥2 h，稱量菌體干重。

空白組：因提取物的溶劑是無水乙醇，以防其對細菌有一定的抑菌效果，影響實驗結果。實驗分2個空白組(一組是用無水乙醇做空白對照，一組是用無菌水做空白對照)，來觀察實驗結果。

無水乙醇空白：含有等量無水乙醇的培養基，每瓶接入4 mm直徑菌餅2塊，同上。

水空白：含有等量水的培養基，每瓶接入4 mm直徑菌餅2塊，同上。

每種菌的操作步驟同上。

1.3 丹參醇提物的體外抑菌活性研究

板1測定丹參醇提物對五種菌的最小抑菌濃度。在96孔細胞培養板A行第一個孔加入160 μL液體培養基，第12孔加200 μL液體培養基，第2～11孔各加100 μL液體培養基。然后，給第一孔加40 μL已知濃度的丹參醇提物后用移液槍充分吹打(至少三次以上)，使藥物與液體培養基充分混勻，然后從第一孔吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之與培養基充分混勻，照此重復至第11孔，吸取100 μL棄去。此時，再給1-11孔加入100 μL移培養好的MRSA1。B-E行同上，最后一步加不同的細菌培養液，分別是加肺炎克雷伯菌、MRSA2、銅綠假單胞菌和傷寒桿菌。

板2～6測定丹參醇提物與抗生素聯合對受試菌的最小抑菌濃度。在96孔細胞培養版的第一列加入140 μL的液體培養基和20 μL丹參醇提物，第12列加200 μL的液體培養基。第2-11列加90 μL液體培養基和10 μL丹參醇提物。A-H行第一孔分別加40 μL八種不同抗生素，用移液槍充分吹打(至少三次以上)，使充分混勻。然后從第一孔吸取100 μL加入到第二孔再充分吹打使之與培養基充分混勻，照此重復至第11孔，吸取100 μL棄去。最后給1～11列每個孔加100 μL細菌培養液。

板7～11測定抗生素本身對受試菌的最小抑菌濃度。在96孔細胞培養版的第一列加入160 μL的液體培養基，第12列加200 μL的液體培養基。第2～11列加100 uL液體培養基。A～H行第一孔分別加40 μL八種不同抗生素，用移液槍充分吹打(至少三次以上)，使充分混勻。然后從第一孔吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之與培養基充分混勻，照此重復至第11孔，吸取100 μL棄去。最后給1～11列每個孔加100 μL細菌培養液。

2 結果分析

2.1 丹參醇提物對五種抗生素耐藥菌的生物量影響結果

液體培養基培養下，丹參醇提物在7 d內對5種抗生素耐藥菌生物量的影響見表1～6。

由表1中數據可知，供試的丹參醇提液在0.1 mg·mL-1時，7 d內MRSA1的菌絲生物量減少了一半左右，其余濃度供試液對MRSA1的菌絲生物量沒有影響。

表1 不同濃度丹參醇提物對MRSA1菌絲濕重和干重的影響

由表2中數據分析得供試的丹參醇提液濃度在0.06 mg·mL-1時，對傷寒桿菌的抑菌效果最佳，其余濃度供試液對傷寒桿菌菌絲的生物量沒有影響。

表2 不同濃度丹參醇提物對傷寒桿菌菌絲濕重和干重的影響

由表3中數據分析得供試的丹參醇提液濃度在0.04 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1時，對肺炎克雷伯菌的菌絲生物量均有控制效果，總體來講，濃度愈高，控制效果愈好。其中濃度處于0.5 mg·mL-1時控制效果最佳，肺炎克雷伯菌的菌絲生物量減少13倍左右；濃度處于0.1 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1時，其對肺炎克雷伯菌的菌絲生物量控制效果相差無幾，菌絲生物量減少2/3左右；濃度處于0.04 mg·mL-1時，肺炎克雷伯菌的菌絲生物量減少一半左右。

表3 不同濃度丹參醇提物對肺炎克雷伯菌菌絲濕重和干重的影響

由表4中數據分析得供試的丹參醇提液各濃度濃度，對MRSA2菌絲生物量均沒有明顯控制作用。

表4 不同濃度丹參醇提物對MRSA2菌絲濕重和干重的影響

由表5中數據分析得供試的丹參醇提液各濃度在對銅綠假單胞菌的菌絲生 物量均沒有明顯控制作用，在0.06 mg·mL-1時，稍有控制作用。

表5 不同濃度丹參醇提物對銅綠假單胞菌菌絲濕重和干重的影響

2.2 丹參醇提物的體外抗菌活性研究

將丹參醇提物單獨用藥時，所測得的MIC值如表6所示：所得結果與之前菌絲生物量控制效果幾近相同，即丹參醇提物單獨用藥時，對五種臨床菌在2 560 mg·mL-1的濃度下均沒有明顯抗菌效果。

為了更好的研究丹參醇提物的抑菌活性，本研究將其與抗生素聯用作用于五種臨床菌，其結果如表6所示：

表6 丹參醇提物單獨用藥的MIC值

由表7中數據可知：丹參醇提物與青霉素、頭孢唑啉鈉、卡那霉素、四環素、氯霉素、紅霉素聯合對MRSA1沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯合對MRSA1的最小抑菌濃度是3 840 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯合對MRSA1的最小抑菌濃度是960 μg·mL-1。

表7 丹參醇提物與抗生素聯合對MRSA1的最小抑菌濃度

由表8中數據可知：丹參醇提物與青霉素、卡那霉素、氯霉素聯合對肺炎克雷伯菌沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢唑啉鈉聯合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是1 920 μg·mL-1；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1；丹參醇提物與四環素聯合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是480 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1；丹參醇提物與紅霉素聯合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是3 840 μg·mL-1。

表8 丹參物與抗生素聯合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度

由表9中數據可知：丹參醇提物與青霉素、卡那霉素、四環素、氯霉素聯合對MRSA2沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢唑啉鈉聯合對MRSA2的最小抑菌濃度是960 μg·mL-1；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯合對MRSA2的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯合對MRSA2的最小抑菌濃度是120 μg·mL-1；丹參醇提物與氯霉素聯合對MRSA2的最小抑菌濃度是1 920 μg·mL-1。

表9 丹參醇提物與抗生素聯合對MRSA2的最小抑菌濃度

由表10中數據可知：丹參醇提物與青霉素、頭孢唑啉鈉、頭孢噻肟鈉、卡那霉素、四環素、氯霉素、紅霉素聯合對銅綠假單胞菌沒有抑菌效果；丹參醇提物與諾氟沙星聯合對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1。

表10 丹參醇提物與抗生素聯合對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度

由表11中數據可知：丹參醇提物與氯霉素、四環素、頭孢唑林鈉青霉素、紅霉素聯合對傷寒桿菌沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度是960 μg·mL-1；丹參醇提物與卡那霉素聯合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度是1 920 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度是60 μg·mL-1。

表11 丹參醇提物與抗生素聯合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度

3 討論與結論

丹參醇提液濃度在0.06 mg·mL-1時，對傷寒桿菌的菌絲生長量有一定抑制影響，濃度在0.04 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1時，對肺炎克雷伯菌的菌絲生物量均有控制效果，且濃度愈高，控制效果愈好，其中濃度處于0.5 mg·mL-1時控制效果最佳，肺炎克雷伯菌的菌絲生物量減少13倍左右。在體外抑菌效果研究中，雖然丹參醇提物單獨用藥抑菌效果不佳，但是與其他抗生素連用均展現不同抑菌效果，尤其展現了其對肺炎克雷伯菌的抑菌效果，其中與頭孢噻肟鈉連用，使抑菌效果提高了6倍。

本課題通過測定菌絲生物量的方法，觀察到液體培養基培養下，丹參醇提物在7 d內對5種臨床常用生物量的影響。分析實驗結果得出丹參醇提物有一定的抑菌活性并得到最佳抑菌濃度。采用微量稀釋法測定丹參醇提物與八種抗生素聯合對五種菌的最小抑菌濃度。本課題只是對新型抑菌劑方面進行小小的一點探索，后續的研究中還需更加全面系統的對其進行研究，為新型抑菌劑方面提供有力的理論依據。