丹參醇提物的抗菌作用研究

陳 穎

(商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院，陜西 商洛 726000)

丹參是唇形科鼠尾草屬，其藥用部位為干燥根及根莖。其味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)。具活血祛瘀、清心除煩、涼血消癰和通經(jīng)止痛等作用[1]。丹參作為我國常用大宗藥材之一，在治療心血管疾病方面作用顯著[2]。丹參的脂溶性成分大多為共軛醌、酮類化合物，主要包括：隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡB，丹參酮ⅡA，等。其中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的含量較高[3]，其脂溶性丹參酮類具有抗菌、血液循環(huán)及消炎等作用[4]，并且隱丹參酮是丹參抗菌的主要有效成分。

近幾年來，細(xì)菌耐藥性問題層出不窮，嚴(yán)重影響大家的身體健康。雖然有很多科學(xué)家投身于解決細(xì)菌耐藥性的問題，但還沒有發(fā)現(xiàn)一個從根本上能夠解決細(xì)菌耐藥性問題的方法[5]。隨著對細(xì)菌耐藥性的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)可從天然產(chǎn)物途徑來發(fā)現(xiàn)能抗菌的成分[6]，特別是從一些藥用植物中探索能夠抑制抗生素耐藥菌的化合物[7]。又有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌不容易對中草藥產(chǎn)生耐藥性，而且我們國家自古以來就擁有十分豐富中草藥資源[8]。由此可看，從中藥中提取新型抑菌劑，或者與抗生素聯(lián)合使用，具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床研究價值。

1 材料與方法

1.1 丹參醇溶性成分的提取

將丹參的干燥根及根莖，粉碎，過60目篩，稱取100 g，倒入1 000 mL燒杯中，加入500 mL無水乙醇，超聲提取60 min，提取液抽濾。將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，至旋干后，倒入一定量的無水乙醇將丹參的醇溶性成分溶解完全，移至帶蓋小試管中，計算其濃度。密封保存待用。

1.2 丹參醇提物對細(xì)菌的生物量影響

首先，在50 mL的具塞試管中加入40 mL的液體培養(yǎng)基，再加入不同濃度的提取液，使提取物的最終濃度為0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.125、0.25、0.4、0.5 mg·mL-1，每瓶接入4 mm直徑菌餅兩塊。然后在振蕩器中37℃震蕩培養(yǎng)，每個濃度重復(fù)兩遍。震蕩培養(yǎng)7 d后抽濾收集菌絲體，用蒸餾水沖洗3次，稱量菌體濕重。然后將菌絲置于80 ℃烘箱中干燥2 h，稱量菌體干重。

空白組：因提取物的溶劑是無水乙醇，以防其對細(xì)菌有一定的抑菌效果，影響實驗結(jié)果。實驗分2個空白組(一組是用無水乙醇做空白對照，一組是用無菌水做空白對照)，來觀察實驗結(jié)果。

無水乙醇空白：含有等量無水乙醇的培養(yǎng)基，每瓶接入4 mm直徑菌餅2塊，同上。

水空白：含有等量水的培養(yǎng)基，每瓶接入4 mm直徑菌餅2塊，同上。

每種菌的操作步驟同上。

1.3 丹參醇提物的體外抑菌活性研究

板1測定丹參醇提物對五種菌的最小抑菌濃度。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板A行第一個孔加入160 μL液體培養(yǎng)基，第12孔加200 μL液體培養(yǎng)基，第2～11孔各加100 μL液體培養(yǎng)基。然后，給第一孔加40 μL已知濃度的丹參醇提物后用移液槍充分吹打(至少三次以上)，使藥物與液體培養(yǎng)基充分混勻，然后從第一孔吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之與培養(yǎng)基充分混勻，照此重復(fù)至第11孔，吸取100 μL棄去。此時，再給1-11孔加入100 μL移培養(yǎng)好的MRSA1。B-E行同上，最后一步加不同的細(xì)菌培養(yǎng)液，分別是加肺炎克雷伯菌、MRSA2、銅綠假單胞菌和傷寒桿菌。

板2～6測定丹參醇提物與抗生素聯(lián)合對受試菌的最小抑菌濃度。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)版的第一列加入140 μL的液體培養(yǎng)基和20 μL丹參醇提物，第12列加200 μL的液體培養(yǎng)基。第2-11列加90 μL液體培養(yǎng)基和10 μL丹參醇提物。A-H行第一孔分別加40 μL八種不同抗生素，用移液槍充分吹打(至少三次以上)，使充分混勻。然后從第一孔吸取100 μL加入到第二孔再充分吹打使之與培養(yǎng)基充分混勻，照此重復(fù)至第11孔，吸取100 μL棄去。最后給1～11列每個孔加100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液。

板7～11測定抗生素本身對受試菌的最小抑菌濃度。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)版的第一列加入160 μL的液體培養(yǎng)基，第12列加200 μL的液體培養(yǎng)基。第2～11列加100 uL液體培養(yǎng)基。A～H行第一孔分別加40 μL八種不同抗生素，用移液槍充分吹打(至少三次以上)，使充分混勻。然后從第一孔吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之與培養(yǎng)基充分混勻，照此重復(fù)至第11孔，吸取100 μL棄去。最后給1～11列每個孔加100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液。

2 結(jié)果分析

2.1 丹參醇提物對五種抗生素耐藥菌的生物量影響結(jié)果

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)下，丹參醇提物在7 d內(nèi)對5種抗生素耐藥菌生物量的影響見表1～6。

由表1中數(shù)據(jù)可知，供試的丹參醇提液在0.1 mg·mL-1時，7 d內(nèi)MRSA1的菌絲生物量減少了一半左右，其余濃度供試液對MRSA1的菌絲生物量沒有影響。

表1 不同濃度丹參醇提物對MRSA1菌絲濕重和干重的影響

由表2中數(shù)據(jù)分析得供試的丹參醇提液濃度在0.06 mg·mL-1時，對傷寒桿菌的抑菌效果最佳，其余濃度供試液對傷寒桿菌菌絲的生物量沒有影響。

表2 不同濃度丹參醇提物對傷寒桿菌菌絲濕重和干重的影響

由表3中數(shù)據(jù)分析得供試的丹參醇提液濃度在0.04 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1時，對肺炎克雷伯菌的菌絲生物量均有控制效果，總體來講，濃度愈高，控制效果愈好。其中濃度處于0.5 mg·mL-1時控制效果最佳，肺炎克雷伯菌的菌絲生物量減少13倍左右；濃度處于0.1 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1時，其對肺炎克雷伯菌的菌絲生物量控制效果相差無幾，菌絲生物量減少2/3左右；濃度處于0.04 mg·mL-1時，肺炎克雷伯菌的菌絲生物量減少一半左右。

表3 不同濃度丹參醇提物對肺炎克雷伯菌菌絲濕重和干重的影響

由表4中數(shù)據(jù)分析得供試的丹參醇提液各濃度濃度，對MRSA2菌絲生物量均沒有明顯控制作用。

表4 不同濃度丹參醇提物對MRSA2菌絲濕重和干重的影響

由表5中數(shù)據(jù)分析得供試的丹參醇提液各濃度在對銅綠假單胞菌的菌絲生 物量均沒有明顯控制作用，在0.06 mg·mL-1時，稍有控制作用。

表5 不同濃度丹參醇提物對銅綠假單胞菌菌絲濕重和干重的影響

2.2 丹參醇提物的體外抗菌活性研究

將丹參醇提物單獨(dú)用藥時，所測得的MIC值如表6所示：所得結(jié)果與之前菌絲生物量控制效果幾近相同，即丹參醇提物單獨(dú)用藥時，對五種臨床菌在2 560 mg·mL-1的濃度下均沒有明顯抗菌效果。

為了更好的研究丹參醇提物的抑菌活性，本研究將其與抗生素聯(lián)用作用于五種臨床菌，其結(jié)果如表6所示：

表6 丹參醇提物單獨(dú)用藥的MIC值

由表7中數(shù)據(jù)可知：丹參醇提物與青霉素、頭孢唑啉鈉、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素聯(lián)合對MRSA1沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯(lián)合對MRSA1的最小抑菌濃度是3 840 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯(lián)合對MRSA1的最小抑菌濃度是960 μg·mL-1。

表7 丹參醇提物與抗生素聯(lián)合對MRSA1的最小抑菌濃度

由表8中數(shù)據(jù)可知：丹參醇提物與青霉素、卡那霉素、氯霉素聯(lián)合對肺炎克雷伯菌沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢唑啉鈉聯(lián)合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是1 920 μg·mL-1；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯(lián)合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1；丹參醇提物與四環(huán)素聯(lián)合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是480 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯(lián)合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1；丹參醇提物與紅霉素聯(lián)合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度是3 840 μg·mL-1。

表8 丹參物與抗生素聯(lián)合對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度

由表9中數(shù)據(jù)可知：丹參醇提物與青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素聯(lián)合對MRSA2沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢唑啉鈉聯(lián)合對MRSA2的最小抑菌濃度是960 μg·mL-1；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯(lián)合對MRSA2的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯(lián)合對MRSA2的最小抑菌濃度是120 μg·mL-1；丹參醇提物與氯霉素聯(lián)合對MRSA2的最小抑菌濃度是1 920 μg·mL-1。

表9 丹參醇提物與抗生素聯(lián)合對MRSA2的最小抑菌濃度

由表10中數(shù)據(jù)可知：丹參醇提物與青霉素、頭孢唑啉鈉、頭孢噻肟鈉、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素聯(lián)合對銅綠假單胞菌沒有抑菌效果；丹參醇提物與諾氟沙星聯(lián)合對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度是240 μg·mL-1。

表10 丹參醇提物與抗生素聯(lián)合對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度

由表11中數(shù)據(jù)可知：丹參醇提物與氯霉素、四環(huán)素、頭孢唑林鈉青霉素、紅霉素聯(lián)合對傷寒桿菌沒有抑菌效果；丹參醇提物與頭孢噻肟鈉聯(lián)合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度是960 μg·mL-1；丹參醇提物與卡那霉素聯(lián)合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度是1 920 μg·mL-1；丹參醇提物與諾氟沙星聯(lián)合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度是60 μg·mL-1。

表11 丹參醇提物與抗生素聯(lián)合對傷寒桿菌的最小抑菌濃度

3 討論與結(jié)論

丹參醇提液濃度在0.06 mg·mL-1時，對傷寒桿菌的菌絲生長量有一定抑制影響，濃度在0.04 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1時，對肺炎克雷伯菌的菌絲生物量均有控制效果，且濃度愈高，控制效果愈好，其中濃度處于0.5 mg·mL-1時控制效果最佳，肺炎克雷伯菌的菌絲生物量減少13倍左右。在體外抑菌效果研究中，雖然丹參醇提物單獨(dú)用藥抑菌效果不佳，但是與其他抗生素連用均展現(xiàn)不同抑菌效果，尤其展現(xiàn)了其對肺炎克雷伯菌的抑菌效果，其中與頭孢噻肟鈉連用，使抑菌效果提高了6倍。

本課題通過測定菌絲生物量的方法，觀察到液體培養(yǎng)基培養(yǎng)下，丹參醇提物在7 d內(nèi)對5種臨床常用生物量的影響。分析實驗結(jié)果得出丹參醇提物有一定的抑菌活性并得到最佳抑菌濃度。采用微量稀釋法測定丹參醇提物與八種抗生素聯(lián)合對五種菌的最小抑菌濃度。本課題只是對新型抑菌劑方面進(jìn)行小小的一點探索，后續(xù)的研究中還需更加全面系統(tǒng)的對其進(jìn)行研究，為新型抑菌劑方面提供有力的理論依據(jù)。