葡萄NIP基因家族的鑒定與表達(dá)分析

吳 宙 ，盧世雄，任家玄，馬宗桓，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070)

水通道蛋白AQP(aquaporin protein，AQP)是位于質(zhì)膜和液泡膜上參與運(yùn)輸水分及一些小分子物質(zhì)的主要內(nèi)在蛋白，屬于古老的通道蛋白MIP(major intrinsic protein，MIP)超家族[1-3]。廣泛存在于動(dòng)物和微生物之中，主要參與介導(dǎo)不同類(lèi)型細(xì)胞水分的跨膜運(yùn)輸、維持水分平衡、逆境調(diào)控等多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[4-5]。根據(jù)其序列相似性，主要可分為4類(lèi)：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins，PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic proteins，TIPs)、類(lèi)根瘤菌26膜內(nèi)在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)和小分子膜內(nèi)在蛋白(small basic intrinsic proteins，SIPs)，不同亞類(lèi)生物學(xué)功能存在較大差異[6-7]。

NIP家族成員Nod26是植物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白，定位于大豆與根瘤菌的共生體膜上，NIP蛋白也存在于非豆科植物的質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[8-10]。結(jié)構(gòu)上，NIP蛋白具有高度保守的結(jié)構(gòu)序列，6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域TM1-TM6(transmembrane，TM)由5個(gè)親水環(huán)連接，第二個(gè)和第五個(gè)環(huán)含有一段由3個(gè)氨基酸組成的高度保守序列NPA(天門(mén)冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸，Asn-Pro-Ala)，兩個(gè)NPA序列間形成狹窄的水通道，其大小決定底物與蛋白的特異性識(shí)別并直接參與水通道的形成[11-13]。在NPA序列外側(cè)存在芳香族氨基酸/精氨酸(aromatic/arginine，ar/R)選擇性過(guò)濾結(jié)構(gòu)，決定運(yùn)輸?shù)孜锏奶禺愋訹14-16]。另外，NIP蛋白不僅參與尿素、甘油等小分子物質(zhì)的運(yùn)輸，還對(duì)硼、砷、硅等非金屬元素具有滲透性，除Nod26蛋白外，大部分NIP對(duì)水的通透性較差或不透過(guò)水[17-18]。其中，擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtNIP5；1和AtNIP6；1具有轉(zhuǎn)運(yùn)硼酸的作用[19-20]；水稻(Oryzasativa)OsNIP2；1[21]、OsNIP2；3[22]以及玉米(Zeamays)ZmNIP2；1、ZmNIP2；1具有轉(zhuǎn)運(yùn)硅元素的作用[23]；擬南芥AtNIP1；1和水稻OsNIP1；1都能轉(zhuǎn)運(yùn)砷[24-25]。此外，干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫均可調(diào)控NIP基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)逆境的耐受力。例如，水稻OsNIP2；1在干旱脅迫下和ABA誘導(dǎo)下表達(dá)下調(diào)，但在鹽脅迫下表現(xiàn)為上調(diào)[26-27]。另外，過(guò)表達(dá)的AtNIP1；2能夠提高擬南芥植株對(duì)鋁脅迫的耐受力[28]，擬南芥AtNIP3；1可提高植株對(duì)砷脅迫的耐受力[29]。

葡萄(VitisviniferaL.)是世界四大水果之一，也是中國(guó)重要的落葉果樹(shù)之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是逆境脅迫會(huì)對(duì)葡萄品質(zhì)提升和種質(zhì)范圍的拓展造成很大的影響[30]。近年來(lái)，有關(guān)水通道蛋白與抗逆性的關(guān)系在擬南芥、煙草(Nicotianatabacum)、玉米以及蘋(píng)果(Malusdomestica)和葡萄等木本植物上都有報(bào)道，但這些研究往往只側(cè)重于某幾個(gè)或某一類(lèi)家族成員[31-32]。不同的品種或物種應(yīng)對(duì)逆境的方式有差異，不同水通道蛋白成員在植株水分吸收中的調(diào)節(jié)作用也不盡相同。因此，有必要從整個(gè)基因家族層面，研究葡萄NIP基因?qū)Νh(huán)境脅迫的響應(yīng)機(jī)理并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步探索該亞類(lèi)基因成員的功能及抗逆分子改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試葡萄品種為‘黑比諾’(Vitisvinifera‘Pinot Noir’)試管苗。配制培養(yǎng)基(MS+0.2 mg·L-1IAA)，pH5.8～6.0，接種實(shí)驗(yàn)材料的單芽莖段部分；培養(yǎng)條件為：25 ℃，16 h光照，20 ℃，8 h黑暗培養(yǎng)35 d。然后轉(zhuǎn)入10% PEG、200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基，同時(shí)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行5 ℃下低溫處理，每種處理設(shè)置3組重復(fù)，對(duì)照為等體積蒸餾水處理，對(duì)照與處理時(shí)長(zhǎng)均為24 h。采集經(jīng)過(guò)處理的葡萄試管苗葉片隨后混勻、稱(chēng)量并置于液氮中速凍，然后放入-80 ℃冰箱中保存。RNA提取采用植物提取試劑盒(中科瑞泰)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄NIP家族成員的鑒定及序列分析以擬南芥NIP蛋白的氨基酸序列為參考序列，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genoscope.cns.fr/)中同源比對(duì)獲得葡萄NIP家族成員的候選序列，在Pfam(https://pfam.xfam.org/)中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對(duì)，去除不含NIP家族成員特定結(jié)構(gòu)域(PF00230)的序列片段，再根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果，參考其他植物水通道命名法對(duì)鑒定到的葡萄NIP家族成員進(jìn)行命名。在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因全長(zhǎng)、CDS序列、氨基酸序列。

利用ExPASy(https://www.expasy.org/)對(duì)葡萄NIP氨基酸序列進(jìn)行等電點(diǎn)、分子量、氨基酸數(shù)目分析；使用TMHMM Server 2.0(https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)目；采用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)家族成員磷酸位點(diǎn)數(shù)目。

利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；采用MEME在線軟件(http：//meme-suite.org/tools/meme)對(duì)葡萄NIP家族成員氨基酸序列進(jìn)行motif分析；利用DNAMAN進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)分析。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、啟動(dòng)子順式作用元件、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析根據(jù)葡萄NIP家族基因的氨基酸序列和從GenBank數(shù)據(jù)中下載獲得的擬南芥和水稻NIP家族成員的氨基酸序列，使用MEGA7.0軟件鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建NIP家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

下載葡萄NIP各基因啟動(dòng)子上游2 kb的序列，利用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)統(tǒng)計(jì)分析各基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的數(shù)量和種類(lèi)。

使用STRING(https://string-db.org)網(wǎng)站對(duì)葡萄NIP成員蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，選取模式植物擬南芥作為參考，最低交互評(píng)分選擇high confidence(0.700)。

1.2.3 表達(dá)譜分析、熒光定量PCR分析和基因克隆從葡萄EFP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bar.utoronto.ca/ efp_grape/cgi-bin/efpWeb.cgi)中收集葡萄NIP基因在11種組織和器官中的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，表達(dá)式數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，熱圖由TBtools軟件制作。

在生工生物工程(上海)股份有限公司網(wǎng)站，將葡萄NIP家族基因的CDS序列進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)，并將設(shè)計(jì)好的引物交由該公司合成(表1)。cDNA合成用Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)用Light Cycler 96實(shí)時(shí)定量PCR儀，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以葡萄GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行特異性表達(dá)分析。擴(kuò)增體系含20 μL，分別包含3 μL cDNA，上、下游引物各0.8 μL，SYBR MIX 10 μL，5.4 μL ddH2O；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，試驗(yàn)3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，并用Origin 9.0繪圖。

表1 葡萄NIP基因家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量和克隆引物

根據(jù)葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載的NIP基因CDS序列設(shè)計(jì)克隆引物，以‘黑比諾’葡萄葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(20μL)：cDNA1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 6.5 μL，Green Taq Mix酶10 μL。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火42 s，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將 PCR 產(chǎn)物切膠回收后送測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證目的基因序列的正確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄NIP基因家族的鑒定及蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析

通過(guò)同源比對(duì)共鑒定出8個(gè)葡萄NIP基因(表2)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果，參考其他植物水通道命名法將葡萄8個(gè)NIP家族成員分別命名為VvNIP1-1、VvNIP2-1、VvNIP3-1、VvNIP4-1、VvNIP4-2、VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1，其中葡萄2、5、10、14號(hào)染色體上各存在1個(gè)NIP基因。葡萄NIP家族蛋白的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示：絕大多數(shù)家族成員氨基酸數(shù)量在201～354之間，其成員氨基酸數(shù)量差異性不大；家族成員蛋白等電點(diǎn)在6.98～9.45之間，說(shuō)明NIP家族蛋白大多編碼堿性氨基酸。葡萄NIP家族基因主要集中在質(zhì)膜中表達(dá)，其次VvNIP4-1、VvNIP4-2在液泡中也有表達(dá)，推測(cè)與其執(zhí)行相關(guān)跨膜運(yùn)輸功能有關(guān)。另外，該家族蛋白含有4～6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，符合水通道蛋白的典型跨膜結(jié)構(gòu)。

表2 葡萄NIP基因家族信息及理化性質(zhì)

葡萄NIP蛋白磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明(表3)，葡萄NIP蛋白的活性受磷酸化調(diào)控，氨基酸序列中存在很多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，且以絲氨酸為主。其中，VvNIP6-1磷酸化位點(diǎn)最多，為39個(gè)，包括24個(gè)絲氨酸、14個(gè)蘇氨酸和1個(gè)酪氨酸；VvNIP4-1和VvNIP4-2最少，有18個(gè)。蛋白質(zhì)磷酸化可提高植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的能力，因此推測(cè)NIP在植物細(xì)胞間傳遞脅迫信號(hào)并進(jìn)行生理和分子水平適應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

表3 葡萄NIP蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)

2.2 基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

葡萄NIP家族基因結(jié)構(gòu)分析顯示(圖1)：該家族基因含有外顯子數(shù)為4～6個(gè)，除VvNIP1-1、VvNIP4-1基因含有4個(gè)內(nèi)含子外，其余均含有3個(gè)內(nèi)含子。另外，僅VvNIP7-1包含基因的上下游外，NIP家族成員序列內(nèi)含子長(zhǎng)度相似，外顯子長(zhǎng)度和位置差異明顯，這可能會(huì)影響基因功能的差異。

利用MEME軟件在線分析葡萄NIP家族基因保守特征結(jié)構(gòu)域(圖1)，共找到6個(gè)motif，其中VvNIP1-1、VvNIP4-1、VvNIP4-2、VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1所含氨基酸保守序列種類(lèi)的數(shù)量均相同，具有高度的保守性，推測(cè)其功能基本相似。另外，VvNIP2-1、VvNIP3-1分別含有4個(gè)和3個(gè)motif，所有NIP家族成員均含有motif4。

圖1 葡萄NIP基因結(jié)構(gòu)分析及保守基序分析Fig.1 Gene structure analysis and analysis of conserved motifs of grape NIP family

2.3 多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了更好地了解葡萄NIP的蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)葡萄NIP蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析(圖2)。結(jié)果顯示，8個(gè)VvNIP結(jié)構(gòu)域保守，其中有4個(gè)成員含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1-TM6)。除VvNIP3-1外它們都含有兩個(gè)高度保守的氨基酸序列天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)，且兩個(gè)NPA主要在第三個(gè)氨基酸易發(fā)生突變，其中VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1中的NPA突變成NPS-NPV，但是由于纈氨酸(V)和丙氨酸(A)同為不帶電荷的非極性氨基酸，所以NPV不會(huì)改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，而且其芳香族氨基酸/精氨酸所形成的ar/R選擇過(guò)濾器對(duì)底物同樣具有選擇透過(guò)性。

紅色框?yàn)镹PA保守結(jié)構(gòu)域；黑色線條為跨膜結(jié)構(gòu)域圖2 葡萄NIP蛋白結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)分析The red boxes are the conserved domains of NPA；The black lines are the transmembrane domainsFig.2 Multiple sequence alignment analysis of domains in grape NIPs

Vv. 葡萄；At. 擬南芥；Os. 水稻圖3 葡萄和其他物種NIP系統(tǒng)進(jìn)化分析Vv. Vitis vinifera；At. Arabidopsis thaliana；Os. Oryza sativaFig.3 Phylogenetic tree analysis of grape NIPs and other species

為了進(jìn)一步了解葡萄NIP家族進(jìn)化及功能特點(diǎn)，對(duì)葡萄、擬南芥、水稻NIP家族基因(AtNIP、VvNIP、OsNIP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，將其分為5個(gè)亞族(A-E)。其中，A亞族包括VvNIP1-1、VvNIP2-1和5個(gè)水稻以及2個(gè)擬南芥NIP家族基因；B亞族只含葡萄和擬南芥NIP家族基因(2個(gè)AtNIP、3個(gè)VvNIP)；C亞族則包含3個(gè)物種的NIP基因(3個(gè)AtNIP、2個(gè)VvNIP、3個(gè)OsNIP)；D亞族只含1個(gè)擬南芥基因AtNIP3-1；E亞族含有AtNIP3-1、OsNIP4-1兩個(gè)基因。在各分支中，葡萄和擬南芥的NIP基因有較高的同源性，進(jìn)化關(guān)系較近，初步表明其進(jìn)化的保守性，推測(cè)直系同源基因之間具有相同的功能。

2.4 葡萄NIP基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

葡萄NIP基因家族成員順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表4)：各個(gè)基因啟動(dòng)子中具有多種應(yīng)答逆境和激素的順式調(diào)控元件，且不同基因的種類(lèi)和數(shù)量均存在較大的差異。8個(gè)NIP基因啟動(dòng)子區(qū)域均含有較多的與光感知應(yīng)答有關(guān)的LR作用元件，說(shuō)明這些成員可能分別在細(xì)胞周期調(diào)控或光敏色素表達(dá)中起到重要的作用。此外，63%的成員含有與干旱有關(guān)的MBS作用元件，50%的成員含有水楊酸TCA和脫落酸ABRE作用元件，37%的成員含有響應(yīng)茉莉酸甲酯的作用元件和響應(yīng)赤霉素應(yīng)答的TATC-box作用元件。因此，葡萄NIP基因可能參與植物的逆境及激素脅迫應(yīng)答過(guò)程。

表4 葡萄NIP基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.5 葡萄NIP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

葡萄NIP成員蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NIP家族成員間蛋白互作關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，與其他AQP亞家族間有著廣泛的互作關(guān)系，其中，與SIP亞族和PIP亞族成員聯(lián)系尤為緊密。另外，PIP亞族成員還與受ABA上調(diào)轉(zhuǎn)錄的植物聯(lián)合蛋白(SYP)有較強(qiáng)的互作關(guān)系。NIP亞家族部分成員還與硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BOR)之間也存在著互作關(guān)系，推測(cè)其可能參與硼酸等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，硼酸是花粉管發(fā)育、受精等生殖生長(zhǎng)中必不可少的微量元素(圖4)。

圖4 葡萄NIP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Grape NIP proteins interaction network analysis

2.6 葡萄NIP家族基因在不同組織中的表達(dá)分析

組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，8個(gè)VvNIP在不同組織或同一組織不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量存在著一定的差異。VvNIP5-1在所有組織中表達(dá)量都很高，在盛花期和幼苗期表達(dá)量較高，分別為322.64和298.18，在衰老葉中表達(dá)量最低為17.18。VvNIP7-1在所有組織中表達(dá)量都相對(duì)較低，其中在萌芽初期和潛伏芽中的表達(dá)量最低，分別為1.84和1.93。VvNIP2-1表達(dá)量逐漸增加，在盛花期表達(dá)量最高達(dá)到485.42。隨著葉的生長(zhǎng)，VvNIP2-1的表達(dá)量下調(diào)，在幼葉中表達(dá)量最高達(dá)到249.24，隨后下調(diào)至14.39，而VvNIP4-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1表達(dá)上調(diào)。在衰老葉中，VvNIP1-1的表達(dá)量最高為135.91。在葉中多數(shù)基因在生長(zhǎng)前期的表達(dá)量顯著高于生長(zhǎng)后期。

圖5 葡萄NIP基因表達(dá)分析Fig.5 Expression profiles of grape NIP family

2.7 葡萄NIP家族基因熒光定量分析及基因全長(zhǎng)克隆

為了進(jìn)一步研究葡萄NIP家族基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)，本研究對(duì)葡萄分別進(jìn)行了鹽、干旱和低溫脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)NIP家族基因成員在3種脅迫下均有基因響應(yīng)，且各處理間相對(duì)表達(dá)量存在著顯著差異(圖6)。200 mmol·L-1NaCl處理下，VvNIP2-1、VvNIP4-2呈上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照的5.1倍、2.7倍；VvNIP1-1、VvNIP3-1、VvNIP4-1、VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1呈下調(diào)表達(dá)。10% PEG誘導(dǎo)后，VvNIP4-2表達(dá)量顯著上調(diào)，為對(duì)照的4.7倍，VvNIP2-1上調(diào)為對(duì)照的1.4倍，VvNIP1-1、VvNIP3-1、VvNIP4-1、VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1呈下調(diào)表達(dá)。5 ℃誘導(dǎo)后，VvNIP1-1、VvNIP2-1、VvNIP3-1、VvNIP4-1、VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1顯著下調(diào)，推測(cè)該基因家族可能受到低溫脅迫抑制。

不同小寫(xiě)字母表示同一處理下不同基因間的表達(dá)差異(P < 0.05)圖6 葡萄NIP基因在不同處理下的表達(dá)分析Different normal letters indicate the expression differences between different genes under the same treatment at 0.05 levelFig.6 Expression of grape NIP gene family under different treatments

以‘黑比諾’葡萄葉片cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)好的4對(duì)PCR引物進(jìn)行VvNIP1-1、VvNIP2-1、VvNIP5-1、VvNIP7-1的擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度為789、606、897、789 bp的片段(圖7)，大小均與預(yù)期目的條帶一致。純化回收目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示成功克隆葡萄VvNIP4-1、VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1基因，且分別編碼262、201、298、293個(gè)氨基酸。

M. DL2000；1. VvNIP1-1；2. VvNIP5-1；3. VvNIP7-1；4. VvNIP2-1圖7 葡萄VvNIP1-1、VvNIP2-1、VvNIP5-1、VvNIP7-1基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Fig.7 PCR products of VvNIP1-1, VvNIP2-1, VvNIP5-1 and VvNIP7-1 genes in grape

3 討 論

水通道蛋白在植物體內(nèi)水分運(yùn)輸、逆境脅迫應(yīng)答、調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[33]。NIP屬于水通道蛋白的一個(gè)亞類(lèi)，其家族的演化是對(duì)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果[34]。目前已報(bào)道的NIP擬南芥中有9個(gè)[35]、水稻10個(gè)[36]、玉米5個(gè)[37]、小麥(Triticumaestivum)4個(gè)[38]、大豆14個(gè)[39]，本研究參照擬南芥NIP亞類(lèi)基因，通過(guò)葡萄全基因組分析，共鑒定到8個(gè)葡萄NIP基因，其數(shù)量與擬南芥和水稻接近。對(duì)葡萄NIP家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)得出，該家族成員主要定位于質(zhì)膜，符合NIP蛋白的細(xì)胞分布特點(diǎn)[9-10]。磷酸化是植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的重要機(jī)制，在葡萄NIP中存在多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，可通過(guò)蛋白質(zhì)的磷酸化迅速對(duì)外界脅迫作出反應(yīng)[40]。經(jīng)對(duì)葡萄NIP進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所編碼蛋白均含有保守的跨膜螺旋區(qū)和特定的保守結(jié)構(gòu)域，且都含有對(duì)NPA基序，其中VvNIP5-1、VvNIP6-1、VvNIP7-1中的兩個(gè)NPA基序進(jìn)化為NPS-NPV，與擬南芥AtNIP5；1和AtNIP6；1一致，因此推測(cè)二者會(huì)參與硼酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[19-20]。蛋白質(zhì)在氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)上具有相似性，使其在功能上也具有一定相通性。因此，推測(cè)葡萄NIP對(duì)小分子物質(zhì)或其他非金屬元素?fù)碛袧B透性，但是其分子機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

葡萄的系統(tǒng)進(jìn)化可分為5個(gè)亞族，其中葡萄與擬南芥同源性較高，例如葡萄VvNIP5-1和AtNIP5；1，VvNIP6-1和AtNIP6；1基因在親緣關(guān)系方面比較接近，推測(cè)他們都參與硼酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[19-20]。啟動(dòng)子元件分析表明多數(shù)VvNIP含有響應(yīng)多種脅迫和激素應(yīng)答元件，推斷它們會(huì)參與植物激素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并且能夠?qū)ζ咸涯婢趁{迫作出應(yīng)答。葡萄組織表達(dá)結(jié)果表明VvNIP亞族中多數(shù)成員在葉中表達(dá)水平較高在莖中較低，這與西洋梨表達(dá)模式有一定的相似性[41]。不同基因在不同階段的表達(dá)，可能與生長(zhǎng)發(fā)育中參與不同的生物過(guò)程有關(guān)。

本研究克隆得到葡萄VvNIP1-1、VvNIP2-1、VvNIP5-1、VvNIP7-1共4個(gè)基因，分別編碼262、201、298、293個(gè)氨基酸。熒光定量結(jié)果表明，葡萄NIP家族基因在低溫脅迫下均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，這與李青云[42]在煙草中多數(shù)NtNIP基因于低溫處理后下調(diào)或不表達(dá)結(jié)果類(lèi)似。推測(cè)在低溫脅迫中可能通過(guò)降低該基因的表達(dá)量來(lái)降低蛋白的活性，從而減少植物體內(nèi)水分的流失，維持植物體的水分平衡，提高植物對(duì)逆境的耐受力。Alexandersson等[43]研究表明多數(shù)AtNIP家族基因在干旱脅迫下表達(dá)下調(diào)。本試驗(yàn)中VvNIP4-2、VvNIP2-1表達(dá)上調(diào)，其余多數(shù)基因表達(dá)呈顯著下調(diào)，該結(jié)果與毛竹(Phllostachysedulis)PeNIP2-1在干旱處理下上調(diào)一致[44]和小麥TaNIP4-1干旱處理下調(diào)一致[45]。推測(cè)下調(diào)時(shí)其可以通過(guò)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，減少蒸騰作用，控制氣孔開(kāi)閉來(lái)應(yīng)對(duì)干旱環(huán)境，上調(diào)則是在逆境中保證植物正常生命活動(dòng)的關(guān)鍵基因。鹽脅迫下，VvNIP2-1、VvNIP4-2呈上調(diào)表達(dá)，其余基因呈下調(diào)表達(dá)，這與玉米在鹽脅迫下的多數(shù)基因表達(dá)下調(diào)結(jié)果類(lèi)似[46]和小麥鹽脅迫下TaNIP4-1表達(dá)下調(diào)一致[45]。不同逆境脅迫下同一基因的表達(dá)存在差異，進(jìn)一步說(shuō)明VvNIP功能的多樣性，而其在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。本研究對(duì)葡萄NIP基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析，并對(duì)鹽分、干旱與低溫脅迫下的響應(yīng)進(jìn)行初步分析，這不僅為今后NIP基因的功能分析和葡萄抗逆性基因資源的挖掘利用提供了有價(jià)值的信息，也為葡萄和其他植物的基因家族擴(kuò)展和進(jìn)化提供參考。