生物樣品組織自由水氚測量制樣方法研究

韓萬春 朱月龍 蔣佳寧 高 陽 朱震宇

（中核核電運行管理有限公司，浙江 海鹽314300）

0 引言

環境中的氚容易通過呼吸道、皮膚接觸、飲用水和食物鏈等途徑進入人體，氚會發出β粒子，在細胞內產生電離，引起細胞DNA的單鏈斷裂，進而導致基因突變[1]。生物樣品氫的同位素分布在自由水和有機化合物中，分布在自由水中的氚稱為組織自由水氚（TFWT），分布在有機化合物中的氚稱為有機結合氚（OBT）[2]。目前自由水氚通用的制樣方法主要有真空冷凍干燥法，高溫蒸餾法，共沸蒸餾法[3]。這些方法都有各自的優缺點（表1）。制得的生物樣品組織自由水氚樣品采用低本底液體閃爍計數器測量氚活 度 濃 度[4，5]。

本文以旋轉蒸發儀為基礎，通過旋轉蒸發法制備樣品以測量生物樣品中組織自由水氚，滿足海洋環境、食品安全領域等監測實驗室日益增加的組織自由水氚樣品制備需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

蘿卜、牛奶、羊肉、大米等環境生物樣品，KMnO4（國藥）、Bradford蛋白定性檢測試劑盒（碧云天）、閃爍液（美國PerkinElmer OPTIPHASE“HISAFE”3）。

1.2 試驗儀器

冷凍干燥儀（美國LABCONCO FREEZONE 2.5plus）、電爐、蛇形冷凝管、旋轉蒸發儀、液閃譜儀（美國PerkinElmer Quantulus1220）、電導率儀（梅特勒）。

1.3 試驗方法

樣品前處理：蘿卜、羊肉等體積大的生物樣品需要切成小塊。

樣品制備：

（1）冷凍脫水干燥法：固體生物樣品直接放在冷凍干燥儀上冷凍抽真空；液體生物樣品放在冰箱里冷凍成冰后，再放在冷凍干燥儀上冷凍抽真空。待組織自由水氚樣品被完全抽出后，樣品解凍，在300 mL制備樣品中加入1 g KMnO4，在蛇形冷凝管上共沸蒸餾，再用液體閃爍計數方法進行測定。

（2）旋轉蒸發法：將生物樣品直接放入加熱瓶內，加熱，旋轉，抽真空，冷凝，定容，再在制得的組織自由水氚樣品中加入1 g KMnO4進行旋轉蒸發，再用液體閃爍計數方法進行測定。制樣結束后，采用水洗氣吹裝置清洗冷凝管壁，防止對下次制樣產生記憶效應（如圖1所示）。

圖1 旋轉蒸發法示意圖

2 結果與分析

2.1 實驗室制備樣品時間統計

冷凍脫水干燥法及旋轉蒸發法制備生物樣品的時間統計見表2。

表2 冷凍干燥法及旋轉蒸發法制備樣品時間統計

2.2 Bradford蛋白定性檢測試劑盒檢測

牛奶是液態生物樣品，含有豐富的蛋白質。蛋白質為有機物，在液閃譜儀測定時會產生干擾。Bradford檢測試劑盒測定蛋白表現出快速、穩定、高靈敏度的特性用，該方法可以判斷制備的自由水氚樣品是否載帶蛋白質。

Bradford蛋白定性檢測試劑遇到原牛奶會變成藍色（如圖2所示）。而Bradford蛋白定性檢測試劑與冷凍干燥機及旋轉蒸發儀制備的樣品都不變色。實驗證明這兩種方法制得的樣品都不會載帶蛋白，不會對實驗產生干擾。

圖2 Bradford蛋白定性實驗

2.3 液閃譜儀測定的樣品結果

真空冷凍干燥法與旋轉蒸發法制備樣品測量結果見表3。

表3 液閃譜儀測定結果

本次實驗采集的都是環境中的生物樣品，發現生物樣品之間有良好的平行性，各生物樣品制得的組織自由水氚電導率都小于5μS/cm，可以滿足液閃測量需要。蘿卜、牛奶、羊肉、大米組織自由水氚測量結果的相對誤差分別為20.3%、5.3%、27.1%、0.8%。

3 結論

真空冷凍干燥法與旋轉蒸發法都能夠制備生物樣品組織自由水氚，旋轉蒸發法的制樣速率比真空冷凍干燥法快幾十倍。旋轉蒸發法還有提取土壤等樣品中自由水氚的能力。目前，國內實驗室基本采用真空冷凍干燥法作為生物樣品組織自由水氚制樣方法，旋轉蒸發法可以作為真空冷凍干燥法的補充。

根據實驗結果，旋轉蒸發儀與冷凍干燥法都能滿足生物樣品中組織自由水氚的測量要求。但是冷凍干燥儀價格昂貴，一般用于生命科學研究領域，如制備肽類化合物樣品等。旋轉蒸發儀價格相對便宜，一般在化學提純中使用較多，主要用于固液分離、液液分離。旋轉蒸發儀在提取生物樣品組織自由水氚時，表現出樣品制備效率高、樣品質量優、能耗小的特點，在生物樣品組織自由水氚提取中有較好的經濟性。

采用旋轉蒸發法制備樣品可以快速準確地測量生物樣品中的組織自由水氚，該方法可以用于常規輻射環境監測、事故應急監測、食品分析及人體內氚含量測量，具有較廣的應用范圍。