分光光度法測定食品中亞硝酸鹽含量標準曲線 線性范圍的研究

魏文強

（通渭縣食品藥品檢驗檢測中心，甘肅通渭 743300）

亞硝酸鹽是一種廣泛使用的食品添加劑，是我國允許使用的食品添加劑之一。常用于乳制品、肉類、腌漬蔬菜等食品加工行業，剩菜剩飯、久置的蔬菜和白開水中也會產生亞硝酸鹽。亞硝酸鹽具有良好的防腐抗氧化、發色及抑菌等作用，能延長食品的保質期，使食物顏色更鮮艷、味道更鮮美，但亞硝酸鹽存在一定的毒性，若過量使用會嚴重影響人們的身體健康。亞硝酸鹽進入人體血液后，會使血紅蛋白變性，血液的攜氧能力降低，造成人體缺氧癥狀，影響人的生命健康[1]。亞硝酸鹽在人體內很容易與蛋白質分解產物在酸性條件下反應轉換成亞硝胺，而亞硝胺是一種強致癌物質，大量或長時間攝入能夠誘發腫瘤的產生，所以必須對食品中的亞硝酸鹽含量進行控制和定量檢測[2]。

1 分光光度法測定亞硝酸鹽標準曲線制作存在的問題

目前，我國檢測食品中亞硝酸鹽的方法依據《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016），檢測方法有離子色譜法和分光光度法[3]。分光光度法具有簡單、快速、靈明度高、經濟等優點，被各檢測實驗室廣泛使用，但在實際的檢測工作發現分光光度法在標準曲線存在以下兩個方面的問題。

1.1 標準曲線線性范圍較窄，高含量食品無法直接測定

根據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定腌臘肉制品類、肉灌腸類、醬鹵肉制品類等食品殘留量以亞硝酸鈉計，殘留量≤30 mg/kg，西式火腿（熏烤、煙熏、蒸煮火腿）類、肉罐頭類等食品殘留量以亞硝酸鈉計，殘留量≤70 mg/kg[4]。按照標準曲線系列濃度里最高點12.5 μg進行計算，取樣品西式火腿5.000 g，代入亞硝酸含量計算公式進行計算，得出該標準曲線的最高點的亞硝酸鈉含量為12.5 mg/kg，因此當西式火腿、肉罐頭等樣品中的亞硝酸鹽含量大于12.5 mg/kg時，按照分光光度法測定，樣品的吸光度值一定大于標準曲線的最高點的吸光度值，超出了標準曲線的范圍，所測定值誤差較大，不能使用。對亞硝酸鈉含量低于12.5 mg/kg檢測樣品可以直接進行測定，但對于亞硝酸含量大于12.5 mg/kg檢測樣品需要進行稀釋后，才能進行測定，當大批量進行樣品檢測時，給檢測工作帶來了額外的工作負擔，造成了試劑的浪費和人力的消耗，同時也會因樣品進行二次稀釋造成最終結果不準確，導致誤差變大[5]。

1.2 標準曲線各點的吸光度值偏低，不在最佳范圍內

吸光度值過大過小都會造成測量誤差。吸光值過小，造成儀器信噪比下降，使分析誤差增大。吸光值過大，會因為雜散光的影響，造成分析結果偏大或偏小，使分析誤差變大。由朗博-比爾定律可知，當普通的分光光度計吸光度值為0.434 3時，吸光度的測量誤差最小。使用分光光度法測定樣品時，吸光度讀數最佳范圍應為0.2～0.8，同時所測定的樣品吸光度值要低于標準系列中的最大吸光度值[6]。采用分光光度計對亞硝酸鹽標準系列最高點12.5 μg的吸光度值進行了反復多次測定，得出的最高吸光度值為0.253 5，標準系列共9個點，其余各標準系列點的吸光度值均小于0.2，表明亞硝酸鹽的標準曲線不在最佳的線性范圍內，得到標準曲線可能不符合質控要求，造成最終的測量結果誤差較大。

為了解決以上存在的兩個問題，提高工作效率，盡量減少實驗誤差，保證檢測結果的準確性，在《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法線性范圍的基礎上對標準曲線的點進行適當的擴展。

2 材料與方法

2.1 實驗試劑

亞硝酸鈉標準溶液（200 μg/mL）、四硼酸鈉（分析純）、對氨基苯磺酸（分析純）、鹽酸萘乙二胺（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、冰乙酸（分析純）、鹽酸（分析純）、蒸餾水。

2.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV8000s）：上海元析儀器有限公司；電子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg）：德國賽多利斯科學儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 改進方法一標準曲線的繪制

取9支50 mL具塞比色管，保持標準中亞硝酸鈉標準使用液的濃度（5 μg/mL）不變，僅改變亞硝酸鈉標準使用液的吸取量，分別加入0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、 2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL（相當于0.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg、12.5 μg、15.0 μg、20.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分別加入2 mL的4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混勻，制得標準系列溶液，室溫下顯色15 min后，以零號管為空白參比，在538 nm波長下測定吸光度。

2.3.2 改進方法二標準曲線的繪制

取9支50 mL具塞比色管，改變標準中亞硝酸鈉標準使用液的濃度，從5 μg/mL改變成20 μg/mL，保持亞硝酸鈉標準使用液的吸取量不變，分別加入0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、 0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.50 mL、2.00 mL（相當于0.0 μg、4.0 μg、8.0 μg、12.0 μg、16.0 μg、20.0 μg、24.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分別加入2 mL的4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混勻，制得標準系列溶液，室溫下顯色15 min后，以零號管為空白參比，在538 nm波長下測定吸光度。

3 結果與分析

3.1 兩種改進方法的標準曲線的比較

由表1和圖1可知，改進方法一的標準曲線方程為y=0.020 8x＋0.000 2，改進方法二的標準曲線方程為y=0.021 1x-0.000 4，兩條曲線的相關系數都在0.999以上，各項均符合要求，能滿足測定要求，圖1中標準曲線一斜率與標準曲線二斜率幾乎一致因此被覆蓋。

表1 兩種改進方法測得標準系列吸光度值的比較

圖1 改進標準曲線對比圖

3.2 實驗驗證

將已知濃度的標準樣品進行吸光度值測定，然后分別帶入標準曲線一、二計算。由表2可知，標準曲線一、二得到的標準樣品濃度均在理論值范圍內。

表2 亞硝酸鹽標準樣品比對實驗測試結果（單位：μg）

4 結論

在《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法的基礎上對標準曲線的點進行適當地擴展，標準曲線主體部分的吸光度值在0.2～0.8。亞硝酸鹽含量較高的待測樣品的吸光度值涵蓋在標準曲線范圍內，能夠滿足亞硝酸鹽含量較高的食品檢測，不需要對樣品進一步稀釋，這兩種改進方法擴大了亞硝酸鹽的檢測范圍，具有操作簡單、靈敏度高、結果準確的特點，可以代替原有的標準曲線，且不影響實驗結果，能夠滿足日常的檢驗要求，值得在實際檢測工作中推廣。