新型近紅外BODIPY類熒光探針的合成及光譜性能

田 琪，盧俊瑞*，謝志強，盧博為，劉金彪

（1.天津理工大學化學化工學院，天津300384；2.南開大學化學學院，天津300071；3.天津大學化工學院，天津300072；4.天津瑞嶺化工有限公司，天津300384）

熒光成像作為一種可視化觀測技術在小分子檢測方面得到了廣泛應用。熒光探針是當今科學和醫學等領域不可或缺的工具，用于臨床診斷、生物化學、材料科學以及環境化學等方面。熒光探針的主要作用原理在于以熒光光譜為手段，通過受體與待測物之間的特異性結合，從而改變熒光基團結構，導致熒光光譜發生改變。通過觀測這種前后變化就可實現對待測物質定性或定量分析。

許多熒光探針的合成可以提高光穩定性，并將發射波長調諧到紅色或近紅外區700~1 100 nm，以避免發射染料的光漂白，加強在熒光成像過程中穿透程度。近紅外分子探針的熒光成像技術具有背景干擾低、對細胞損傷小、樣品穿透性強、檢測靈敏度好等優點，展現了較好的應用前景。因此，近紅外熒光染料在生物檢測領域具有許多的優勢[1-4]。

熒光探針種類繁多，如香豆素類、萘衍生物類、啡啶吖啶類、熒光素類、羅丹明類等，且均具有優良的性能。其中氟硼二吡咯（boron dipyrromethene，BODIPY）類熒光染料的優勢較為突出[5]，其基本結構單元具有易于進行化學修飾、熒光量子產率高、摩爾消光系數高等優點[6]，越來越受到人們的關注。因為熒光探針具有較高的選擇性、高靈敏度、良好的光學穩定性等優點，被廣泛應用于生物標記、探針檢測及生物成像。

本文合成出一種新型近紅外BODIPY類熒光探針，通過克腦文蓋爾（Knoevenagel）反應延長側鏈，增強共軛效應，使化合物的熒光發射波長接近700 nm，具有優異的光化學性能，有潛力成為一種非常有應用前景的BODIPY類熒光探針。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

本實驗所用儀器包括：FL-4500型熒光分光光度計（日本日立公司），UV-3310型紫外可見分光光度計（日本日立公司），BS223S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），德國Bruker 400 MHz型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀（德國Bruker公司），X-4型顯微熔點儀（北京科儀電光儀器公司），溫度計未經校正，Waters超高液相色譜高分辨質譜聯用（UPLC-HRMS）儀，層析薄板（天津市江天統一科技有限公司）。

本實驗所用試劑包括：三氟乙酸，三氟化硼乙醚，哌啶，2，4-二甲基吡咯（純度98%，天津希恩思生化科技有限公司），三乙胺（分析純，天津科威化工科技有限公司），溶劑CDCl3-d1，內標四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS），1H NMR，13C NMR。

1.2 實驗過程

1.2.1 BODIPY-1的合成

新型BODIPY-1的合成路線如圖1所示。取100 mL三口圓底燒瓶，加入3，5-二溴苯甲醛1 g（3.32 mmol），進行N2置換，避光，加入二氯甲烷（dichloromethane，DCM）和2，4-二甲基吡咯0.75 mL（7.30 mmol），室溫攪拌10 min。隨后加入0.05 mL三氟乙酸。每隔30 min進行薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）分析，待原料消失。除去氮氣保護，加入用10 mL DCM溶解的0.83 g（3.65 mmol）2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（2，3-dichloro-5，6-dicyano-1，4-benzoquinone，DDQ），繼續反應3 h。在冰浴條件下，加入10.20 mL三乙胺，繼續攪拌20 min，緩慢滴加12.50 mL三氟化硼乙醚，待反應恢復室溫后過夜。水洗，用二氯甲烷萃取，硅膠柱層析（CH2Cl2）得到橙紅色固體0.52 g，收率為51%。

圖1 新型BODIPY-1的合成路線Fig.1 Synthetic route of new BODIPY-1

1.2.2 BODIPY-2的合成

新型BODIPY-2的合成路線如圖2所示。在100 mL單口圓底燒瓶中加入產物1物質0.50 g（1.04 mmol）、4-溴苯甲醛0.96 g（5.20 mmol）和對甲苯磺酸0.04 g（0.21 mmol），加入適量哌啶，加熱至120℃，密閉條件下反應2 h。水洗，硅膠柱層析（CH2Cl2），得到紫黑色固體0.63 g，收率為74.3%。

圖2 新型BODIPY-2的合成路線Fig.2 Synthetic route of new BODIPY-2

2 結果與討論

2.1 反應條件探索

由于第一步合成BODIPY-1，該反應成熟，反應條件溫和，收率穩定，所以著重針對Knoevenagel反應進行研究，分別針對反應物的反應溫度、物料配比、反應時間等條件進行優化設計。首先，反應溫度分別設為90℃、95℃、100℃、110℃、120℃、140℃。哌啶和甲苯高溫易揮發，為了體系物料保持不變，不影響反應進程，因此體系為密閉環境。在物料配比1∶2∶2的條件下，密閉反應2 h，甲苯溶劑中反應副產物過多，經過優化除去甲苯，單獨使用哌啶為溶劑，反應收率依次是28.9%、44.3%、57.9%、62.7%、74.3%、65.6%。實驗結果顯示，該反應在120℃時收率最高，則最佳反應溫度為120℃。升高溫度收率沒有明顯變化，且副產物增多。

針對反應的投配比進行優化，反應條件篩選如表1所示。投料比對反應收率的影響較大，當物料摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2時，反應不完全，原料剩余。當物料摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2.2時，反應收率提高，副產物較少。當物料摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2.5時，反應收率降低，副產物逐漸增多。從經濟的角度確定最佳摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2.2。

另外，考察了時間對反應收率的影響，反應加熱2 h為最佳反應時間，收率達到74.3%，延長反應時間收率無明顯提高。因此，最終確定合成BODIPY-2的最佳反應條件為：哌啶作為溶劑，BODIPY-1與醛的當量比為n（1）∶n（醛）=1∶2.2，120℃反應2 h，如表1所示。

2.2 結構分析

由表2產物1，2的表征數據可知，以CDCl3作為氘代溶劑，化合物BODIPY-1，2經1H NMR進行了表征。通過化合物BODIPY-1和BODIPY-2兩組氫譜的對比可知，在Knoevenagel反應后，化合物BODIPY-1在化學位移2.56上對應兩個甲基的單峰消失，并且在芳香區出現兩組氫，應為碳碳雙鍵上的氫。由此可知，共軛結構已形成，從而確認化合物BODIPY-2的結構。

表2 產物1，2的表征數據Tab.2 Characterization data of products 1，2

2.3 BODIPY-1，2的紫外和熒光光譜的測定

將BODIPY-1，2溶解于氯仿中，配成濃度為50μM的氯仿溶液，進行紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的測定，圖3為BODIPY-1，2在氯仿中的紫外-可見吸收光譜圖，圖4為BODIPY-1，2在氯仿中的熒光光譜圖。

圖3 BODIPY-1，2在氯仿中的紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra of BOPDIPY-1，2 in chloroform

圖4 BODIPY-1，2在氯仿中的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of BOPDIPY-1，2 in chloroform

由圖3可知，BODIPY-1在氯仿中的最大吸收波長λmax為487 nm，而BODIPY-2在氯仿中的最大吸收波長λmax為596 nm，出現明顯的紅移現象。從對實驗現象的觀察可知，固體外觀的顏色從橙色紅變成藍紫色。

將BODIPY-1，2配制成濃度為50μM的氯仿溶液，進行熒光性質測試。由圖4可知，BODIPY-1的發射波長為λEm=552 nm，BODIPY-2的發射波長為λEm=711 nm，光譜紅移，接近紅外區域。

3 結論

本文通過Knoevenagel反應對BODIPY類化合物進行修飾，延長側鏈結構，合成了一種新型近紅外的BODIPY類熒光探針，并進行了結構驗證。利用紫外熒光測試，探究了探針的光譜性能，發現共軛效應增強，光譜紅移。