電子束輻照滅菌對昭通醬品質影響研究

李俊杰，張正彪，李 浪，3，余平蓮*，臧永清

（1.昭通學院 化學化工學院，云南 昭通 657000；2.云南省高校高原特色功能食品研究重點實驗室，云南 昭通 657000；3.云南食品安全昭通研究院，云南 昭通 657000）

我國醬類產品品種眾多，如大（黃）豆醬、豆瓣醬、牛肉醬、甜面醬、芝麻醬、花生醬等，其市場需求逐年增多，行業發展趨勢良好[1-2]。昭通醬為昭通本地特有的大豆醬，呈鮮紅色，有濃烈的醬香味，因產于昭通而得名，其主要原料為大豆，富含多種活性物質，對人體有保健功能。相比市面上其它豆醬，昭通醬有兩個比較明顯的特色。昭通醬是經過兩次發酵周期制成的，第一次發酵主要是黃豆在自然條件下進行發酵，以真菌發酵為主。第二次發酵是在一次發酵的基礎上經過刷霉、粉碎、加料、攪拌等步驟進行發酵，以細菌發酵為主。也因此傳統昭通醬加工至少半年才能制成。昭通醬屬于大豆發酵類醬制品，在生產和運輸過程中，易造成微生物污染，影響醬本身的口感[3]。傳統大豆醬通常采用低溫密封包裝、干燥、氣調等技術進行儲藏，但存在操作麻煩、成本稍高、殺蟲滅菌效果不徹底等缺點。陳書蓓[4]利用熱耦合超聲對黃豆醬進行滅菌處理，發現豆醬中大腸桿菌和膜醭畢赤酵母菌的致死率與滅菌的時間和溫度符合動力學模型；周民生[5]研究表明，豆醬能夠更好的保護真菌免受高溫高壓的影響，90 ℃條件下處理20 min，只能降低醬體中霉菌和膜醭畢赤酵母菌2～3個數量級，而豆醬超高壓滅菌方式基本可行，且符合一定的動力學原理。加熱處理能有效殺滅豆醬中部分微生物，但絕大多數分微生物甚至致病菌在加熱處理后仍然處于“亞致死”或者“存活但不可培養”的狀態，殘留的微生物又會進一步污染樣品，因此大多數加熱滅菌需進行二次熱處理[6]。電子束輻照滅菌其原理是將電子加速成高能電子產生電子射線，將電子射線能量轉移給被輻射物，使得被輻射物中微生物體內發生電離，激發自由基等分子方面發生變化，從而達到殺菌的目的。因其殺菌效果明顯，不帶入新的雜質，以及“冷殺菌”的特點備受關注[7]。BHAT R等[8]探究了不同劑量電子束輻照對蓮子的成分以及蛋白質功能特性的影響，研究證明電子束輻照能夠延長產品的貨架期；KIM H J等[9]采用10 kGy及以下電子束劑量處理牛肉干，其殺菌有明顯的效果，而且并不影響其感官品質；目前我國電子束輔助主要用于糧食、果蔬、畜禽肉類以及一些水產品類，而在醬類調味品中應用卻少見。昭通醬在當地的生產加工主要按照傳統的工藝進行作坊式生產，并沒有統一的標準可參考，且由于發酵過程全在露天自然環境下進行且周期長，無論在發酵還是儲藏過程中容易生霉，熱殺菌又易導致風味和色澤發生改變，因此很難實現工業化、產業化的發展。因此昭通醬長遠的發展對策就是先實現包裝-滅菌等工序。考慮到昭通醬自身含有豐富的營養和獨特的風味成分，如果對其進行傳統的加熱殺菌，勢必會使得產品營養流失，甚至會產生其他不好的風味。因此，本實驗以昭通醬的感官評價、部分營養及理化成分為評價指標，研究電子束輻照劑量對其品質的影響，旨在為昭通醬在產業化發展提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昭通醬：本實驗室自制（原料產地昭通，無任何添加劑）；平板計數瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯：北京路橋技術股份有限公司；二甲基亞砜、乙腈、甲醇（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；6種大豆異黃酮標準品（大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素）（純度均＞99%）：天康生物科技有限公司；磷酸、氫氧化鈉、五水硫酸銅、亞甲基藍、鄰苯二甲酸氫鉀、甲基紅、鹽酸、溴甲酚綠、乙酸鋅、冰乙酸、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、乙醇、氫氧化鉀、硼酸、酚酞、硫代硫酸鈉、石油醚、三氯甲烷、碘化鉀、無水硫酸鈉、可溶性淀粉、重鉻酸鉀、硫酸鉀、硫酸、堿性藍6B（均為分析純）：天津市津北精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀（含G1314 B-二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD）、G1311 A 四元泵、G1316 A柱溫箱、G1329 A自動進樣器）：美國安捷倫公司；AUW-220 D 電子分析天平：日本島津公司；GW1030型超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；BDW 1-202-1ASB/1A恒溫干燥箱：北京中西華大科技有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：北京同德創業科技有限公司；TY15/ZX 10003分析天平：北京海富達科技有限公司；NKB 3300自動凱氏定氮儀：上海祎鴻分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

實驗室自制昭通醬用聚乙烯自封袋分裝（每袋500 g，攤平尺寸12 cm×10 cm×3 cm左右），進行輻照。昭通醬的輻照處理在湖南湘華大生物科技有限公司進行，輻照劑量設置為0、2 kGy、4 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy、12 kGy，實測劑量分別為0.00、2.10 kGy、3.68 kGy、5.80 kGy、8.15 kGy、9.80 kGy、12.48 kGy，以上每個劑量設6個平行，每包樣品分別在上下兩面的中心和對角處貼上劑量計（片），實測劑量為各處平均劑量，不均勻度為單個樣品中最高劑量與最低劑量值得比值，本實驗不均勻度控制在1.5以內，輻照后的樣品均貯藏于4 ℃冰箱中待測。

輻照處理：依托湖南湘華華大生物科技有限公司，采用威視IS1020電子加速器，輻射源：反波型行波電子直流加速器，能量（10±0.5）MeV，額定工作束流功率（20±2）kW，掃描頻率5～20 Hz，連續可調。

1.3.2 感官評價標準

表1 昭通醬的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of Zhaotong soybean paste

1.3.3 微生物指標測定

菌落總數：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》執行[10]；霉菌：參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》執行[11]；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》執行[12]。

1.3.4 部分理化指標測定

蛋白質測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》執行[13]；脂肪測定：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》執行[14]；還原糖測定：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》執行[15]；過氧化值測定：參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》執行[16]；酸價測定：參照GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》執行[17]；總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》執行[18]。

1.3.5 大豆異黃酮測定方法

參照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法》[19]進行測定并略作改進。

（1）分別取6種大豆異黃酮標準貯備溶液4 mg置于10mL容量瓶中，加入少量體積分數50%的二甲基亞砜，超聲波處理30 min待其完全溶解，再用體積分數50%的二甲基亞砜定容。6種大豆異黃酮溶液的質量濃度均為400 mg/L。配制質量濃度8.0 mg/L、16.0 mg/L、24.0 mg/L、32.0 mg/L、40.0 mg/L的混合標準溶液。

（2）稱取樣品0.05～0.5 g（精確至0.1 mg），用體積分數80%的甲醇溶液溶解并轉移至50 mL容量瓶中，加入體積分數80%的甲醇溶液至接近刻度。把樣品溶液用超聲波振蕩器600 W振蕩20 min，用體積分數80%的甲醇溶液定容，搖勻。取樣品溶液置于離心管中，5 000 r/min離心15 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾，收集濾液備用。

（3）液相色譜條件

C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈，流動相B：磷酸水溶液（pH=3.0），流速1.0 mL/min，波長260 nm，柱溫30 ℃。

洗脫梯度：0 min 12%乙腈，10 min 18%乙腈，23 min 24%乙腈，30～50 min 30%乙腈，55 min 80%乙腈，56～60 min 12%乙腈。

1.3.6 氨基酸測定方法

結合GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[20]和武俊瑞等[21]的方法略作改進，增加了半胱氨酸的檢測，氨基酸的測定依托湖南省農科院湖南省食品測試中心。

1.3.7 數據處理

每個實驗需連續做3次，實驗數據處理分析時取3次實驗平均值進行分析，采用Excel 2016軟件、Origin 9.0、IBM SPSS statistics 26等軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照劑量對昭通醬感官評價的影響

由表2可知，隨著輻照劑量的增加，昭通醬口感、氣味和滋味對輻照表現出一定的敏感性，當輻照劑量為5.80 kGy時，氣味就開始發生一定的變化，但不影響滋味和口感，當輻照劑量增加至8.15 kGy時，滋味和口感也開始發生改變，明顯能感受出一定的異味，當輻照劑量增加至12.48 kGy時，色澤開始出現異常，顏色開始變暗，說明較高劑量會影響昭通的品質。因此最佳輻照劑量不應超過3.68 kGy。

表2 電子束輻照劑量對昭通醬感官評價的影響Table 2 Effect of electron beam irradiation dose on sensory evaluation of Zhaotong soybean paste

2.2 電子束輻照劑量對昭通醬微生物的影響

由表3可知，電子束輻照對昭通醬中微生物的數量影響顯著（P＜0.05），隨著輻照劑量的增加，昭通醬中菌落總數、真菌含量和大腸桿菌數量下降明顯，當輻照劑量達到2.01kGy時，大腸桿菌數量達到最低檢出值以下；當劑量達到3.68 kGy時真菌數量達到最低檢出值以下；當輻照劑量達到8.15 kGy時，菌落總數降至最低檢出值以下，說明電子束輻照能有效抑制昭通醬中微生物數量，使其達到微生物商檢標準，延長保鮮期。

表3 電子束輻照劑量對昭通醬微生物的影響Table 3 Effect of electron beam irradiation dose on microorganism of Zhaotong soybean paste

電子束輻照劑量與菌落總數、真菌數量和大腸桿菌數量均呈負相關，根據輻照劑量與菌落總數對數值的線性變化，可得出其回歸方程為y=-0.884 0x+7.052 8（R2=0.999 7），由此可計算出D10值（指殺滅90%微生物所需的輻射劑量）為1.16 kGy。當輻照劑量為3.68 kGy時，昭通醬中菌落總數為未輻照時的0.07%，同時真菌數和大腸桿菌數已低于最低檢測限，達到衛生標準。電子束輻照是用電子加速器產生的高能電子束照射可使一些物質產生物理、化學和生物學效應[22]。食品中的含水量也會影響輻照滅菌的效果，因為在干燥狀態下照射，生成的游離基因失去了水的連續相而變得不能移動，游離基等的輻射間接作用就會隨之降低，因而輻射作用顯著減弱[23-24]。而昭通醬作為一種特色醬類，其含水量比較高，因此在輻照過程中更容易發生電離，使微生物失活或者死亡。因此說明昭通醬的輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

2.3 電子束輻照劑量對昭通醬部分理化指標的影響

電子束輻照劑量對昭通醬部分理化指標的影響見表4。由表4可知，隨著輻照劑量的增加，昭通醬的還原糖和蛋白質含量呈略微下降的趨勢；脂肪含量先略微下降，當輻照劑量超過3.68 kGy時下降明顯，后隨輻照劑量增加下降趨于平緩。隨著輻照劑量的增加，昭通醬的總酸含量幾乎不變；酸價值略微上升；而過氧化值隨著輻照劑量的增加而上升，當輻照劑量超過9.80 kGy時，過氧化值上升明顯。因此根據輻照滅菌不應改變營養成分及理化指標的原則，說明昭通醬的輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

表4 電子束輻照劑量對昭通醬營養及理化指標的影響Table 4 Effect of electron beam irradiation dose on nutrition and physical and chemical indexes of Zhaotong soybean paste

2.4 電子束輻照劑量對昭通醬大豆異黃酮的影響

由表5可知，在輻照劑量為0～2.01 kGy時，染料木苷、大豆素、染料木素、大豆黃素和大豆黃苷5種大豆異黃酮含量呈略微上升的趨勢，當輻照劑量為2.01～12.48 kGy時，含量隨著輻照劑量的增加逐漸減少，而且劑量越大下降速度越快；大豆苷的含量隨輻照劑量的增加始終呈下降的趨勢。這6種大豆異黃酮均含有羥基、碳氧雙鍵、碳氧單鍵和碳碳雙鍵，可能在輻照過程中發生脫氯化氫反應與降解反應，產生共軛雙鍵，含多官能團不飽和的物質會在輻照下產生交聯反應[25-27]。根據前人研究可知，多官能團不飽和單體在輻照引發下優先產生自由基并自聚[28-29]，這很可能是大豆異黃酮含量隨著輻照劑量的增加而下降的主要原因。從變化趨勢可知當輻照劑量達到5.80 kGy時，6種大豆異黃酮含量下降趨勢明顯，且下降幅度開始增大，因此從大豆異黃酮的指標分析，昭通醬電子束輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

表5 電子束輻照劑量對昭通醬中6種大豆異黃酮含量的影響Table 5 Effect of electron beam irradiation dose on 6 soybean isoflavones content of Zhaotong soybean paste

2.5 電子束輻照劑量對昭通醬氨基酸的影響

電子束輻照劑量對昭通醬氨基酸含量的影響見表6。由表6可知，昭通醬中共檢測出17種氨基酸，主要由賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和谷氨酸組成。隨著輻照劑量的增加，其中賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、組氨酸和脯氨酸呈微上升趨勢，異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸和絲氨酸呈下降趨勢。當輻照劑量達到5.80 kGy時，必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、總氨基酸（total amino acid，TAA）、SAA和呈味氨基酸（delicious amino acids，DAA）的變化明顯，結合表4中蛋白質含量隨輻照劑量的增加而微微下降，有可能因為隨著輻照劑量的增加，促進了蛋白質的水解，從而導致氨基酸含量的增加，從DAA/TAA值看，低劑量輻照對呈味氨基酸的變化影響較小，當輻照劑量超過9.80 kGy時，DAA/TAA值下降明顯，說明此時昭通醬中風味物質發生了明顯的改變。電子束滅菌對昭通醬中氨基酸的形成有一定的促進作用，但光靠考察氨基酸含量的變化不能直接表明輻照對昭通醬的風味和營養有一定積極作用，因此從保證樣品原有的風味和營養特征的前提下，昭通醬的電子束輻照劑量不宜超過3.68 kGy。顧可飛等[30]研究發現，對農產品中，蛋氨酸及蛋白質特定的二級結構對電子束輻照相對敏感；梅卡琳等[31]的研究也表明，電子束輻照對蟹肉的氨基酸組成及其營養價值沒有明顯的不利影響，與本研究結果基本類似。

表6 不同劑量電子束輻照處理昭通醬中的氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of Zhaotong soybean paste treated by different doses of electron beam irradiation

3 結論

本實驗以昭通醬的感官評價、部分營養及理化成分為考查指標，研究電子束輻照劑量對其品質的影響。結果表明，當輻照劑量為2.01 kGy時，昭通醬中大腸桿菌含量降到最低檢測水以下，此時脂肪的含量開始呈下降趨勢，過氧化值開始上升，大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素5種大豆異黃酮含量呈微微上升的趨勢，大豆苷呈下降趨勢；當輻照劑量為3.68 kGy 時，昭通醬中真菌數量已經下降到最低檢測水平以下，脂肪的含量繼續呈下降趨勢，下降速度減緩，當輻照劑量達到5.80 kGy時，昭通醬氣味開始有所改變，而且6種大豆異黃酮含量下降變的明顯；當輻照劑量為8.15 kGy 時，口感和滋味開始發生改變，菌落總數含量已經下降到最低檢測水平以下，此時氨基酸含量變化明顯，過氧化值和酸價值變化變大；當輻照劑量為9.80 kGy時，口感、氣味和滋味變化嚴重，產生了一些不愉快的氣味和滋味，脂肪含量繼續小幅度下降，氨基酸含量繼續變化；當輻照劑量為12.48 kGy時，昭通醬色澤開始變暗，過氧化值上升速度和幅度加快，大豆異黃酮下降速度變快，氨基酸含量開始變少，特別是呈味氨基酸下降比較明顯。因此根據各指標變化情況，表明3.68 kGy電子束輻照劑量既能殺死昭通醬中大多數微生物，使得菌落總數為未輻照時的0.07%，延長貨架期，又能最大限度保持昭通醬中原有的理化指標及風味成分，是有效的昭通醬輻照滅菌劑量。