副干酪乳桿菌對酒精致肝損傷小鼠生長性能和肝臟的影響

胡盼盼

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.山西農業大學動物醫學學院，山西 晉中 030801）

肝臟可以通過體內酶的新陳代謝對酒精進行生物轉化[1]，并通過將酒精排出體外進行解毒，但酒精濫用則可導致肝臟嚴重的病理改變，引發嚴重的肝臟疾病，酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）已經成為威脅人類健康的重要原因[2]，對個人和社會造成了不良的影響[3]。ALD可從酒精性肝損傷開始，發展為酒精性肝炎或脂肪變性[4]，并進一步發展為肝纖維化或肝硬化[5]，甚至最終導致肝癌。細胞損傷、炎癥、氧化應激等是酒精誘導肝損傷的主要因素[6]，目前針對ALD的治療手段有限且藥物治療具有明顯副作用[7]，針對微生物或天然物質具有較強的抗氧化活性，因此開發保肝護肝的功能食品具有重要意義。

益生菌是有益于人體健康的微生物[8]，具有抗菌、抗癌、抗氧化和抗過敏作用、降低血脂、增強免疫功能[9]，并具有菌株依賴性。乳酸桿菌和雙歧桿菌是應用最廣泛的益生菌。乳酸菌為革蘭氏陽性菌[10]，廣泛分布于自然界。近年來，一些菌株被發現還具有其他重要的生物學功能，如抗衰老和抗氧化活性等[10]。實驗室前期從新疆馬奶酒中自行篩選分離鑒定得到副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisupsp.paracasei）M5L，該菌株具有良好的發酵性能及生物活性，并且已經驗證其菌體[11]、胞外多糖[12]、發酵液等具有免疫和抗腫瘤等功能。因此，本研究構建酒精慢性肝損傷小鼠模型，研究副干酪乳桿菌M5L對小鼠生長性能和肝功能的影響，對深入開發乳酸菌保肝功能食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及動物

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisupsp.paracasei）M5L：分離自新疆馬奶酒中，由哈爾濱工業大學食品科學與工程系保藏[13]。

雄性昆明小鼠（體質量25～28 g）：北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證號SCXK（滬）2017-0011），飼養溫度為（21±1）℃，相對濕度為（60±5）%，光照12 h/d。實驗室通風良好，小鼠自由攝食及飲水。

1.1.2 試劑

谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒：南京建成生物工程公司；白酒（酒精度56%vol）：汾酒集團有限責任公司；無水乙醇、二甲苯（均為分析純）：天津市津東天正精細化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Eon型酶標儀：美國BioTek公司；BSA224S型電子稱：廣東省精密儀器公司；MultiModeⅢa型顯微鏡：美國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組與給藥

小鼠先進行5 d的適應性喂養后，每組10只，隨機分成四組：分別為對照組（CON組）、模型組（MOD組）、低劑量副干酪乳桿菌M5L處理組（107CFU/mL，L-M5組）、高劑量副干酪乳桿菌M5L處理組（108CFU/mL，H-M5組）。

副干酪乳桿菌處理組小鼠按0.15 mL/10 g的劑量灌胃副干酪乳桿菌液，對照組、模型組小鼠灌胃給予等體積蒸餾水，處理2 h后對照組給予蒸餾水，其他各組按0.15 mL/10 g劑量灌胃白酒（酒精度56%vol），每天1次，連續28 d。

1.3.2 小鼠體質量的變化

小鼠飼養28 d后，分別記錄初始和結束后小鼠的體質量，計算體質量增長率，其計算公式如下：

1.3.3 小鼠胸腺指數和脾臟指數的變化

小鼠飼養28 d后，稱體質量，頸椎脫臼處死取出脾臟和胸腺，分別稱質量，并計算相應的臟器指數，其計算公式如下：

1.3.4 小鼠肝臟的病理變化

肝臟形態的變化：小鼠飼養28 d后，頸椎脫臼處死，取出小鼠肝臟，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色[14]，顯微鏡下觀察小鼠肝臟的病理變化。

肝功能的變化：小鼠飼養28 d后，頸椎脫臼處死，取出肝組織稱質量，加入9倍質量的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，3 500 r/min離心20 min，取上清液，采用試劑盒測定小鼠血清中ALT、AST的含量和肝臟中GSH、SOD、MDA的含量。

1.3.5 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0.1統計軟件統計數據并作圖，不同字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠體質量的影響

由表1可知，與對照組相比，模型組、副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠體質量增長率均顯著降低（P＜0.05），但與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠體質量增長率明顯升高（P＜0.05），由此說明副干酪乳桿菌M5L能夠促進小鼠的生長，這可能是由于副干酪乳桿菌M5L具有保護小鼠腸胃，提高機體性能，從而使小鼠飲食量增加的緣故[8]。

表1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠體質量的影響Table 1 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on body weight of mice with alcoholic liver injury

2.2 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠免疫系統功能的影響

胸腺和脾臟是機體主要的免疫組織，參與機體細胞免疫和體液免疫，可以有效激活T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞參與免疫反應，因此可以根據胸腺指數和脾臟指數衡量小鼠的免疫功能[14]。由表2可知，與對照組相比，模型組小鼠脾臟指數和胸腺指數均顯著減小（P＜0.05），說明酒精傷害小鼠免疫組織的發育。與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠的胸腺指數均明顯增加（P＜0.05），且呈現濃度依賴性，菌體濃度越大，胸腺指數增加越顯著（P＜0.05），且高低劑量差異顯著（P＜0.05）。對于脾臟指數，低劑量的副干酪乳桿菌處理不能顯著的增大小鼠的脾臟指數（P＞0.05），但高劑量組則可以顯著的增加小鼠的脾臟指數（P＜0.05），且高低劑量組之間差異顯著（P＜0.05）。由此說明，副干酪乳桿菌M5L能在一定程度上改善酒精致小鼠機體免疫組織的傷害。

表2 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠免疫器官的影響Table 2 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on immune organ of mice with alcoholic liver injury

2.3 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

2.3.1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟形態的影響

由圖1可知，對照組小鼠肝臟未見充血、腫脹和炎癥現象，肝細胞輪廓清晰，排列整齊；模型組小鼠肝臟出現明顯充血腫脹的情況，大量肝細胞堆積在一起，細胞形態嚴重破壞，低劑量副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠雖然還有一定的充血情況，但形態有所好轉，高劑量副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟炎癥顯著減小，無充血，肝細胞形態也恢復正常，說明副干酪乳桿菌M5L可以有效的改善小鼠肝臟的病理狀態。

圖1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟形態的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on liver morphology of mice with alcoholic liver injury

2.3.2 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響

谷丙轉氨酶是判斷肝細胞損傷的重要指標之一，位于肝細胞胞漿內，當細胞損害后，谷丙轉氨酶從細胞流入血液，從而導致谷丙轉氨酶在外周血清中濃度的升高[15]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠血清中ALT活性顯著增高（P＜0.05），說明酒精造成肝臟嚴重的傷害。與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠血清中ALT活性顯著降低（P＜0.05）。

谷草轉氨酶又名天門冬氨酸氨基轉移酶，當肝臟受到病理性破壞就會釋放到血液中，導致血清中的谷草轉氨酶含量越高，肝臟受損程度越嚴重[9]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠血清中AST活性顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠血清中AST活性均顯著降低（P＜0.05），由此說明副干酪乳桿M5L能改善小鼠肝功能修復能力。

表3 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響Table 3 Effects of Lactobacillus paracasei M5L on liver function mice with alcoholic liver injury

丙二醛是衡量細胞損傷的重要指標，正常機體中也存在一定含量的MDA，但在脂質過氧化過程中大量產生，還會產生一系列的自由基，從而加劇機體損傷[16]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟的MDA含量顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟的MDA的含量均顯著降低（P＜0.05），說明副干酪乳桿菌M5L可以阻止酒精導致的肝細胞氧化及產生自由基。

機體的氧化平衡需要抗氧化酶的參與，超氧化物歧化酶為活性最強的抗氧化酶。SOD可以清除超氧陰離子自由基，防止脂質過氧化，減輕其對細胞的損害，因此含量越高，說明抗氧化能力越強[17]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟的SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟的SOD活性均顯著升高（P＜0.05），且呈現濃度依賴性，劑量越大，效果越顯著，高低劑量之間存在顯著差異（P＜0.05），且顯著高于對照組（P＜0.05）。由此說明副干酪乳桿菌M5L具有一定的抗氧化能力。

GSH是組織中一種含巰基的三肽，由半膚氨酸、谷氨酸及甘氨酸組成，GSH代謝過程能參與體內氧化還原過程，能自由基結合，防止細胞破壞，同時還可對抗自由基對肝臟的損害[18]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟的GSH含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟的GSH含量均顯著增加（P＜0.05），甚至顯著高于對照組（P＜0.05），說明副干酪乳桿菌M5L抗氧化能力較強，可改善小鼠機體性能。

3 討論

乙醇是一種很容易穿過細胞膜的小分子[19]，影響乙醇吸收和代謝的因素很多，包括性別、年齡、種族和體質量，低于體積分數10%的乙醇可以直接被肺、腎和汗液排出。乙醇生物轉化的主要代謝途徑是氧化成乙醛，該過程需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的參與，主要通過乙醇脫氫酶實現，乙醇脫氫酶主要存在于肝臟和胃腸道中[20]，過量飲酒即可引發酒精性肝損傷。KIM N H等[21]給予C57BL/6J小鼠八周酒精處理后發現，小鼠天冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶的顯著升高，小鼠肝細胞受到嚴重的破壞，脂肪堆積明顯，此外產生大量的自由基和炎癥因子；LI C等[22]通過給C57BL/6小鼠酒精處理發現，小鼠肝臟受到嚴重的破壞，大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生。本研究結果與前人研究結果一致，模型組小鼠肝臟MDA含量顯著增多，抗氧化酶顯著降低，說明酒精肝損傷的確與氧化失衡相關。

乳酸菌作為主要的益生菌，具有抗氧化的作用，能夠促進腸道菌群平衡，抑制致病細菌生長，具有生物拮抗作用，其代謝產物參與了機體屏障的構建[23]。實驗室前期已經對副干酪乳桿菌M5L體外抗氧化能力進行了測定，結果表明副干酪乳桿菌M5L體外可以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基以及具有較強的還原力，表現出良好的抗氧化活性，且在體內能有效的抑制ROS的產生[24]。此外，大量研究表明乳酸菌可以顯著改善酒精導致的肝臟損傷。許女等[25]研究發現，山西老陳醋植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）C181處理，可顯著降低慢性酒精誘導昆明小鼠肝臟中甘油三酯和游離脂肪酸的含量，以及血清中AST和ALT的活性；陸婷等[26]采用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG或MRS培養基將小鼠連續處理4周后再采用體積分數50%的乙醇灌胃，結果發現酒精處理導致小鼠ALT和AST活性顯著升高，脂肪合成相關基因表達顯著升高，脂肪分解相關基因表達顯著降低，經過鼠李糖桿菌LGG處理后呈現不同程度的逆轉，表明鼠李糖桿菌LGG具有保護小鼠急性酒精性肝損傷的作用。本研究結果與前人研究結果一致，高低劑量的副干酪乳桿菌M5L干預能夠顯著改善小鼠的生長性能，并增強小鼠肝臟的抗氧化能力。

4 結論

本研究通過建立酒精性肝損傷小鼠模型，研究了副干酪乳桿菌M5L對小鼠生長性能和肝功能的影響。結果表明，與模型組小鼠相比，副干酪乳桿菌M5L處理后能顯著提高小鼠的體質量（P＜0.05），顯著增大胸腺指數和脾臟指數（P＜0.05）；減輕小鼠肝臟水腫、充血，肝細胞壞死的情況，并且顯著降低小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）活性（P＜0.05），顯著降低小鼠肝臟中丙二醛（MDA）的含量（P＜0.05），顯著增加小鼠肝臟中超氧化歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）的含量（P＜0.05）。綜上，副干酪乳桿菌能夠提高酒精致肝損傷小鼠的生長性能，并增強小鼠肝臟的抗氧化能力，對乳酸菌作為保肝護肝功能食品的開發具有重要意義。