抑制饅頭中腐敗霉菌活性乳酸菌的篩選及其應用

王慶宇，李 嘯，*，宋宜兵，胡新平，劉玲彥，談亞麗，王帥靜，程 奔

（1.三峽大學 生物與制藥學院 中國輕工業酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.湖北省酵母功能重點實驗室安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000；3.湖北安琪生物集團有限公司，湖北 宜昌 443000）

饅頭是以小麥粉和水為原料，以酵母菌為主要發酵劑揉成面團，經發酵、定型、醒發后蒸制而成的食品[1]。饅頭作為我國的傳統主食，在人們的飲食結構中占據重要地位，隨著人民生活節奏的加快，主食工業化必將成為未來的發展趨勢，饅頭的工業化生產將是其中重要的組成部分[2-4]。但因饅頭營養豐富，含水量較高，儲存期間很容易受到細菌和霉菌的作用而腐敗，貨架期極短等因素都制約著饅頭工業化生產的發展步伐[5-6]。化學防腐劑作為一種能夠抑制食品中微生物生長而延長食品保質期的物質，在食品行業已被廣泛使用，但其濫用和過量使用對人類健康造成的危害問題也逐漸受到消費者的關注[7]。隨著人們對食品安全和品質要求的提高，綠色安全無毒副作用的生物防腐劑逐漸成為研究熱點，生物防腐劑憑借其抗菌活性強、安全無毒、熱穩定性好、抑菌譜廣等特點正逐步展現出替代化學防腐劑的趨勢[8]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的統稱[9]。乳酸菌安全無毒，無致病性和致癌性，在世界范圍內被公認為安全等級“一般認為安全（generally recognized as safe，GRAS）”的食品微生物[10]。乳酸菌作為益生菌，在食品工業的生物防腐領域也有一定的應用價值，PLESSAS S等[11]采用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）以及兩者的混合菌分別發酵酸面團制作面包，發現混合菌發酵的酸度更高且制作出的面包比其他面包的保質期更長；錢洋[12]測試了3株乳酸菌發酵液對面包儲藏期限的影響，結果發現與對照組相比，噴灑了發酵液的面包的儲藏期限均得到相應的延長。

本研究從發霉饅頭中分離主要腐敗霉菌，并通過形態觀察及分子生物學技術對其進行鑒定。以分離得到的腐敗霉菌為指示菌，從實驗室保藏的食品級乳酸菌中篩選對腐敗霉菌具有較強抑制活性的菌株，通過對其發酵液進行過氧化氫酶、蛋白酶、不同溫度及pH處理，初步分析上清液中抑菌物質的特性。最后將該菌株發酵制備的酸面團用于饅頭的防霉應用中，并與添加量為0.5 g/kg（以脫氫乙酸計）的脫氫乙酸鈉的防霉效果作對比，為饅頭工業化生產開發綠色安全的生物防腐劑奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

饅頭：儲存6 d后發霉的饅頭；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP-1、LP-2、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LR-1、LR-2、LR-3、副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC-1、LC-2、LC-3：由安琪酵母菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基、MRS固體和MRS肉湯培養基：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 試劑

過氧化氫酶（5 000 U/mg）、蛋白酶K（40 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；乳酸、氫氧化鈉（均為分析純）：西隴科學股份有限公司；脫氫乙酸鈉（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C全自動生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司；BHC-1300IIA型生物潔凈安全柜：蘇州凈化設備有限公司；FE22 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250BSH-II生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；XCS-HJSG-3恒溫攪拌三聯水浴鍋：陜西鑫昌實驗儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 饅頭中腐敗霉菌的分離與鑒定

無菌操作下稱取5 g發霉饅頭碎屑于裝有45 mL無菌水的試管中，振蕩混勻，再吸取1 mL混勻液體加入9 mL無菌水中，依次進行10倍梯度稀釋，吸取100 μL稀釋液均勻涂布于PDA培養基上，30 ℃條件下培養3 d，觀察各菌落的形態，選取兩株形態數量最多的菌落做進一步分離純化，純化后的菌落參考《真菌鑒定手冊》[13]進行形態學觀察，并委托北京六合華大基因科技有限公司進行真菌18S rDNA測序。將測得的序列結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的18S rDNA基因序列，使用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹[14-15]。

1.3.2 霉菌孢子懸液的制備

將純化后的霉菌接種在PDA斜面上，30 ℃條件下培養7 d至霉菌產生大量孢子，加入30 mL無菌生理鹽水于斜面培養瓶中，充分振蕩后的清洗液經無菌紗布過濾除去菌絲，獲得孢子懸液，采用血球計數板計數[16]。

1.3.3 乳酸菌發酵上清液的制備

將甘油管冷凍保藏的乳酸菌解凍后，吸取100 μL接種于10 mL MRS肉湯培養基進行復壯，37 ℃條件下培養48 h。復壯后再以5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養基進行活化，37 ℃條件下培養24 h。活化后的乳酸菌以5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養基中，37 ℃條件下培養48 h，培養液經5 000 r/min離心15 min后，上清液經0.22 μm濾膜過濾除菌即得到乳酸菌發酵上清液[17]。

1.3.4 乳酸菌抑菌活性的測定

（1）乳酸菌菌株抑菌活性的測定

將活化后的乳酸菌菌株在MRS固體培養基中于37 ℃條件下培養48 h。將孢子懸液（孢子濃度為3.6×107～5.2×107CFU/mL）以1%（V/V）的接種量接入冷卻至50 ℃左右的PDA培養基中，取5 mL含有霉菌孢子懸液的PDA培養基傾倒在上層，待其凝固后，30 ℃條件下培養48 h，根據乳酸菌周圍抑菌圈直徑的大小評價抑菌效果[18]。

（2）乳酸菌發酵液抑菌活性的測定

發酵上清液抑菌活性的測定參考胡誠等[19]的微量孔板法并稍作修改：在每個孔中依次加入100 μL乳酸菌發酵上清液、200 μLPDB培養基和50 μL霉菌孢子懸液，以100 μL的MRS肉湯培養基替代乳酸菌發酵上清液作為對照組。將孔板置于30 ℃條件下培養48 h后，使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在波長580 nm處測定吸光度值（OD580nm值），并計算抑菌率，其計算公式如下：

1.3.5 乳酸菌生長特性的分析

活化后的乳酸菌，按5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養基中，混合均勻后取300 μL加入到微孔板的孔中，37 ℃條件下培養，每30 min取樣測定吸光度值（OD600nm值），另外每隔4 h取樣測定乳酸菌發酵液的pH值，測得數據用于乳酸菌生長曲線及發酵液pH變化曲線的繪制。

1.3.6 不同培養條件對菌株LP-1發酵上清液抑菌活性的影響

溫度、酶及pH值對菌株LP-1發酵上清液抑菌活性的影響：取5 mL菌株LP-1發酵上清液分別在-20 ℃、4 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃條件下保持30 min[20]；取10 mL菌株LP-1發酵上清液分別加入1 mg/mL過氧化氫酶（pH 7.3）、胰蛋白酶（pH 8.1）和蛋白酶K（pH 7.0），37 ℃水浴2 h后，100 ℃水浴滅酶3 min，將pH調回發酵上清液的初始值[21-22]；使用1 mol/L乳酸和1 mol/L NaOH溶液分別將菌株LP-1發酵上清液的pH值調節為3、4、5、6、7和8[23]；以未處理的乳酸菌發酵上清液作為對照組，采用微量孔板法測定各實驗組的抑菌率。

1.3.7 乳酸菌在饅頭防霉中的應用

將活化后的乳酸菌按5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養基，37 ℃條件下培養24 h，離心棄上清液，獲得的菌體經無菌水清洗兩次后備用。按菌體、面粉、水質量比為0.01∶1.00∶1.00的配比混合均勻，密封置于37 ℃醒發箱發酵12 h即獲得酸面團。按表1的4種配方分別制作饅頭[24]，蒸制好的饅頭用自封袋包裝后儲存于37 ℃醒發箱中，分別測定和記錄面團的pH值、蒸制后饅頭的pH值以及饅頭儲存過程出現明顯可見霉斑的時間點。

表1 饅頭的制作配方Table 1 Formulations for making Mantou

2 結果與分析

2.1 饅頭中腐敗霉菌的分離與鑒定

從發霉的饅頭中共分離純化出2株主要的腐敗霉菌，分別編號為A1、A2，其菌落及細胞形態見圖1。

圖1 腐敗霉菌A1（a）及A2（b）的菌落及細胞形態Fig.1 Morphology of colonies and cells of spoilage molds A1(a)and A2(b)

由圖1可知，菌株A1的菌落呈綠色或青綠色，邊緣有白色絨毛且菌落中心有突起，分生孢子梗頂生排列成帚狀的間枝，分生孢子呈鏈狀排列，球形至卵圓形。菌株A2的菌落初呈黃色后漸變為黃綠色，成熟后顏色變暗，分生孢子梗粗壯無分枝頂囊，分生孢子呈球形或近球形。

采用分子生物技術對2株腐敗霉菌進行鑒定，系統發育樹見圖2。由圖2可知，菌株A1與Penicillium expansum聚于一支，親緣關系最近；菌株A2與Aspergillus flavus聚于一支，親緣關系最近。結合形態觀察，鑒定菌株A1、A2分別為擴展青霉（Penicillium expansum）、黃曲霉（Aspergillus flavus），此結果與文獻[25]中報道的相一致。

圖2 基于18S rDNA基因序列腐敗霉菌A1、A2的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of spoilage molds A1 and A2 based on 18S rDNA gene sequences

2.2 不同乳酸菌抑菌效果評價

由表2可知，供試乳酸菌對兩株霉菌均表現出一定的抑菌作用，其中，植物乳桿菌LP-1對兩種霉菌的抑制效果都較為突出，故確定該菌株為優良菌株。

表2 不同乳酸菌對霉菌的抑菌活性比較Table 2 Comparison of antimicrobial activities of different lactic acid bacteria against molds

2.3 植物乳桿菌LP-1生長曲線及發酵液pH變化曲線

為了解植物乳桿菌LP-1的生長以及產酸情況，測定該菌株的生長曲線以及生長過程中發酵液的pH變化，結果見圖3。

由圖3可知，在發酵0～4 h內，植物乳桿菌LP-1的生物量變化緩慢為延滯期；發酵4～14 h內，其生物量迅速增長，為對數生長期；發酵14 h后生物量基本維持不變進入穩定生長期。植物乳桿菌LP-1發酵液的pH值在0～8 h內由6.16迅速降低至4.25，8～12 h由4.25緩慢降至3.98，12 h后基本維持不變并最終降至3.87。故后續實驗使用該菌發酵制備酸面團時，以發酵12 h為發酵終點。

圖3 植物乳桿菌LP-1的生長曲線及發酵液pH變化曲線Fig.3 Growth curve of Lactobacillus plantarum LP-1 and pH change curve of fermentation broth

2.4 培養條件對植物乳桿菌LP-1發酵上清液抑菌活性的影響

溫度、酶、pH值對植物乳桿菌LP-1發酵上清液抑菌率的影響見圖4。

由圖4a可知，植物乳桿菌LP-1發酵上清液經過不同溫度處理后，對擴展青霉和黃曲霉的抑菌率與室溫條件（約25 ℃）下未處理的發酵上清液相比均無明顯差異，說明發酵上清液中的抑菌物質對溫度處理不敏感，在溫度-20～121 ℃的范圍內具有良好的穩定性。

由圖4b可知，發酵上清液經過過氧化氫酶、蛋白酶K以及胰蛋白酶處理后對擴展青霉的抑菌率分別為75.46%、77.99%和76.04%，與未處理的原液抑菌率（81.67%）相比略有下降；對黃曲霉的抑菌率分別為72.52%、73.85%和74.23%，與未處理的原液抑菌率（73.75%）相比無明顯差異，表明植物乳桿菌LP-1發酵上清液中的抑菌物質并不是過氧化氫或蛋白類細菌素起主要的抑菌活性，可能是乳酸菌產生的其他代謝產物發揮主要抑菌活性作用。

圖4 溫度（a）、酶（b）及pH（c）對植物乳桿菌LP-1發酵上清液抑菌率的影響Fig.4 Effects of temperature (a),enzyme (b) and pH (c) on the inhibition rate of Lactobacillus plantarum LP-1 fermentation supernatant

由圖4c可知，不同pH對植物乳桿菌LP-1發酵上清液的抑菌率影響較大，當pH為3和4時，發酵上清液對擴展青霉和黃曲霉的抑制作用與原液相比未見明顯改變；當pH值≥5時，植物乳桿菌LP-1發酵上清液對擴展青霉和黃曲霉的抑制作用均明顯降低；pH值為6時發酵上清液對擴展青霉和黃曲霉的抑制作用最低，分析推測發酵上清液中起主要抑菌作用的物質為乳酸菌產生的有機酸類代謝產物。

2.5 植物乳桿菌LP-1在饅頭防腐中的應用

采用4種配方制作饅頭時，面團的pH值、饅頭的pH值以及饅頭在儲存過程中出現明顯可見霉斑的時間點見表3，各實驗組饅頭儲存6 d后的霉變情況見圖5。

表3 4種配方制作饅頭時面團的pH、饅頭的pH及霉斑出現時間Table 3 pH of dough and Mantou and the appearance time of mildew spots in the Mantou-making with 4 formulas

圖5 4種配方制作的饅頭儲存6 d后的霉變情況Fig.5 Mildew of Mantou made with 4 kinds of formula after storage for 6 d

由表3可知，1#、2#配方制作饅頭時，面團的pH值（4.09、4.31）和饅頭的pH值（4.03、4.39）均明顯低于3#、4#配方，2#、3#配方制作出的饅頭在第2天表面出現了可見霉斑，1#、4#配方制作出的饅頭在第4天表面出現了可見霉斑，表明40%酸面團添加量制作出的饅頭的防霉效期與0.5 g/kg脫氫乙酸鈉添加量（以脫氫乙酸計）的一致，較空白對照組（3#配方）相比延長了2 d。2#、3#配方制作的饅頭儲存6 d后表面發粘，由圖5可知，2#、3#配方制作的饅頭儲存6 d后饅頭的腐敗程度及表面霉菌的菌落大小均明顯高于1#、4#配方制作的饅頭。

3 結論

本研究采用稀釋涂布平板法從發霉饅頭中分離得到2株主要腐敗霉菌，經形態觀察及分子生物學鑒定分別為擴展青霉（Penicillium expansum）和黃曲霉（Aspergillus flavus），以其作為指示菌，從實驗室保藏的乳酸菌中篩選得到一株抑霉菌活性優良的植物乳桿菌LP-1。植物乳桿菌LP-1發酵上清液在溫度-20～121 ℃范圍內具有很好的穩定性，且對蛋白酶和過氧化氫酶處理均不敏感，在pH為3～4的酸性條件下抑菌物質能展現出較好的抑菌性能，pH≥5時抑菌活性顯著降低，分析推測發酵上清液中的抑菌物質為乳酸菌產生的有機酸類代謝產物。植物乳桿菌LP-1發酵制得的酸面團用于饅頭的制作，37 ℃密封儲存，40%酸面團添加量配方制作的饅頭在第4天表面出現可見霉斑，較空白對照組延長2 d，其防霉效果與0.5 g/kg脫氫乙酸鈉添加量相當，表現出較好的生物防腐性能，為饅頭工業化生產開發綠色安全生物防腐劑奠定研究基礎。